雷帕霉素抑制小鼠骨髓移植后移植物抗宿主病作用的初步研究

【摘要】  目的：探讨新型免疫抑制药物雷帕霉素（RAPA）对小鼠异基因骨髓移植(allo-BMT)后急性移植物抗宿主病（aGVHD）的抑制作用,并与传统免疫抑制药物比较作用效果。方法：用主要组织相容性抗原(MHC) 完全不合的纯种近交系小鼠［供鼠为雄性C57BL/6J (H-2b) 鼠,受鼠为雌性BALB/c (H-2d) 鼠］建立allo-BMT/aGVHD动物模型，随机分5组，第1、2和3组分别给予RAPA、环孢菌素A(CsA)加甲氨蝶呤(MTX)、RAPA加CsA加MTX联合用药作为aGVHD抑制方案，第4组为空白对照，第5组为未移植组。观察各组小鼠骨髓移植后aGVHD的出现情况。结果：移植小鼠出现典型的aGVHD症状，未用aGVHD预防方案的移植小鼠(第4组) 死亡高峰在移植后第5～7天,死亡率达100 %。用不同aGVHD预防方案的第1～3组小鼠aGVHD症状明显减轻,平均生存时间(MST) 较第4组显著延长(分别延长3.5、1.9和6.0 d,P<0.05)。不同aGVHD预防方案的移植小鼠之间，移植后外周血常规变化差异无显著性。经用各预防方案后,移植小鼠aGVHD病理表现减轻,且RAPA、CsA和MTX联合用药组的病理分级轻于RAPA单药组或CsA加MTX标准方案组。结论：RAPA可以显著抑制体外T淋巴细胞增殖效应，增强小鼠对骨髓移植的免疫耐受，对小鼠骨髓移植后移植物抗宿主病（GVHD）有明显抑制作用，可减轻GVHD症状和病理损害程度，延长平均生存时间。

【关键词】  雷帕霉素； 移植物抗宿主病； 异基因骨髓移植； 小鼠

    造血干细胞移植( hemopoietic stem cell transplantation, HSCT) 是目前血液系统恶性肿瘤和非恶性遗传性缺陷的重要手段。对于许多没有相关全相合或无关全相合骨髓供者的恶性血液病患者来说，用半相合的亲属或部分相合无关供者的骨髓作为干细胞来源，成为治疗恶性血液病的必然选择。但同种异体HSCT后移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD) 的发生率为50 %～80 %，移植相关死亡率约30 %，严重影响患者的生存时间和生存质量，是临床异基因干细胞移植的障碍之一［1］。研究降低或减轻GVHD的发生率及程度的方法，对临床HSCT有重要意义。选用较强的联合免疫抑制方案预防和治疗HSCT后异基因骨髓移植后急性移植物抗宿主病(aGVHD)成为解决问题的方法之一。本实验研究新型免疫抑制药物雷帕霉素(rapamycin,RAPA)对aGVHD的防治作用及其初步作用机制,选择C57BL/6J鼠(H-2b) 、BALB/c鼠(H-2d) 分别作为不相合基因移植的供、受者，建立aGVHD模型。用RAPA以及联合环孢菌素A(CsA)加甲氨蝶呤(MTX)对aGVHD的抑制作用进行了小鼠实验观察。

    1  材    料

    1.1  实验动物

    供鼠：纯种近交系小鼠C57BL/6J (H-2b),雄性,清洁级,8～12周龄,购自扬州大学动物中心。受鼠：纯种近交系小鼠BALB/c (H-2d ),雌性,清洁级,8～12周龄,购自扬州大学动物中心。小鼠饲养于东南大学公共卫生学院SPF级动物房内。垫料经高温消毒,移植后20 d内每天更换垫料,饲料经60Co照射灭菌,饮水中加入红霉素250 mg·L-1、庆大霉素320 mg·L-1，于移植前5 d开始饮用。

    1.2  主要试剂

    RAPA为美国惠氏制药公司产品,CsA为瑞士Sandoz 公司产品,MTX为上海华联制药公司产品。

    2  方    法

    2.1  全身照射

    采用60 Co (南京市第二放疗中心)γ射线作全身照射,剂量率500 cGy·min-1,总剂量8.0 Gy。

    2.2  骨髓移植

    无菌条件下采集C57BL/6J 小鼠股骨，用注射器吸取RPMI 1640 培养液反复冲洗骨髓腔制成细胞悬液，过4 号针头使之成为单细胞悬液, 采用淋巴细胞分离液(密度1.083 g· ml-1) 分离单个核细胞，调整细胞浓度为1×108 ml-1。将脾脏在200 目筛网上研磨成单个细胞，0.83 % NH4Cl 溶解红细胞,调整细胞浓度为1×108 ml-1。受鼠BALB/c在全身照射后6～8 h接受骨髓移植(经尾静脉输注骨髓和脾细胞悬液0.2 ml·只-1)。

    2.3  实验动物分组

    小鼠随机分为第1、2、3、4、5共5组，每组10只：(1)第1组小鼠RAPA 1.5 mg·kg- 1 ·d - 1灌胃，从移植后第1天(+1 d) 开始用药；(2)第2组小鼠给予CsA加MTX，CsA 1.5 mg·kg- 1 ·d - 1腹腔注射，从移植后+1 d开始用药，当小鼠的胃肠功能逐渐恢复后改为CsA 5 mg·kg- 1·d- 1灌胃，MTX 0.4 mg·kg- 1 ·d- 1腹腔注射，移植后+1,+3,+6,+11 d用药；(3)第3组小鼠给予RAPA(1.5 mg·kg- 1·d- 1) 联合CsA+MTX(RAPA、CsA、MTX用药同前) ；(4)第4组为空白对照,即移植后未用药防治GVHD；(5)第5组照光后未予骨髓移植。

    2.4  观察指标

    2.4.1  嵌合体鉴定  在移植后不同时间取骨髓细胞进行染色体C带染色，油镜下数40个染色体数目完整的分裂相。记录含Y染色体细胞所占比例。

    2.4.2  一般情况、GVHD积分  观察移植小鼠体重、体型、体位、毛发、腹泻和死亡情况。根据腹泻、皮炎、肝脏和体重下降等情况分析，将GVHD分为无(无GVHD，0分)、轻度(0分

    2.4.3  血常规监测  移植后每次取3只小鼠，隔天眼球后采血，放于白细胞稀释液稀释，常规计数白细胞。

    2.4.4  病理检查  取濒死小鼠活杀取肝、小肠和皮肤等制备石蜡切片,常规苏木精-伊红染色,观察aGVHD病理表现。

    2.5  统计学处理

    数据采用两个独立样本t检验、单因素方差分析和多因素方差分析。均通过SPSS 15.0 for Windows专业统计软件进行分析。

    3  结    果

    3.1  嵌合体鉴定

    用染色体C带染色法鉴定受鼠骨髓细胞性染色体。在存活2～3周的异基因骨髓移植(allo-BMT)雌性BALB/c小鼠骨髓细胞中，XY染色体出现率为30/40～40/40,说明受鼠体内为供鼠来源细胞造血重建。

    3.2 平均生存时间（MST）、GVHD发生情况和GVHD积分    用不同aGVHD预防方案的第1～3组小鼠aGVHD症状明显减轻,MST较第4组显著延长(分别延长3.5、1.9和6.0 d,P<0.05)，见表1。

    小鼠aGVHD症状、体征：第4组的移植小鼠于+3～+5 d即出现少食、少动、消瘦、腹泻、弓背体位和毛发紊乱无光泽等aGVHD症状,小鼠的死亡高峰期在+5～+7 d。aGVHD预防方案组(第1～3组)于+7 d左右出现弓背翘毛、腹泻和脱毛等症状,迟于第4组；各实验组小鼠aGVHD症状持续进展,最终死亡,死亡率为100 %。未用药组GVHD出现时间早于各用药组，腹泻量明显增多，活动量明显减少，进食量少甚至不食。

    第1～5组GVHD积分分别为3.35、5.01、2.83、8.41和8.0。表1  不同aGVHD 预防方案小鼠MST

    移植后各组小鼠的外周血白细胞计数（2×109～5×109 L-1）明显低于移植前（8×109～9×109 L-1）。各组小鼠外周血白细胞数在移植后不同时间差异均无显著意义(P>0.05)。第5组小鼠第7天造血开始恢复。

    3.4  病理表现

    未用aGVHD预防方案的第4组表现为皮肤中大量淋巴细胞浸润,灶性上皮与真皮分离或上皮明显缺损。肝脏汇管区大量淋巴细胞浸润，胆小管变性坏死,肝细胞浊肿、点状坏死。肠管黏膜下层大量淋巴细胞浸润，局灶、节段性肠黏膜坏死、脱落。各aGVHD预防方案组病理改变较轻，其中第3组的病理表现轻于第1组,第2组的病理表现稍重于第1组。见图1～3。

    4  讨    论

    异基因外周血HSCT是恶性血液肿瘤的重要手段,通过移植供者造血细胞，包括免疫活性细胞达到疾病根治目的。而GVHD是HSCT成功的主要障碍，移植物中的免疫活性细胞启动移植物抗宿主反应，这一现象最初是在给被照射小鼠输注正常鼠脾细胞后认识的［2］。其发生是由移植物中的抗原特异性淋巴细胞识别宿主组织抗原而发生的一种排斥反应。所以目前防治GVHD的主要方法是移植前后应用免疫抑制剂和细胞毒药物,以及去除移植物T细胞的移植。因此,选用较强的联合免疫抑制方案预防和治疗allo-BMT后GVHD成为亟待解决的问题。

    RAPA为吸水性链霉菌(streptomyceshygroscopicus) 产生的大环内酯类抗真菌抗生素,它是一种新型的免疫抑制剂,有研究发现RAPA有强效免疫抑制活性,已证实具有较强的抗排斥活性以及延长移植物存活的能力。国内外广泛用于实体脏器(肾、心、肝)移植后急性排斥反应的防治，并取得良好效果［3］。RAPA与CsA合用有协同作用并可减少CsA剂量［4-5］。RAPA无肾毒性,可分别与低剂量他克莫司(FK506)、CsA、霉酚酸酯(MMF) 或激素组合成不同的联合免疫抑制方案,已取得了较好的临床疗效［6-7］。

    国内目前RAPA在临床用于骨髓移植后aGVHD的防治尚处于起步阶段，并且缺少相关动物实验研究。目前已知RAPA防治aGVHD的机制可能主要是抑制细胞因子介导的T 细胞激活与增殖,阻断IL-2 和IL-2R 后的信号传递通路，从而抑制T 细胞增殖与IL-2R 的表达［8］。经研究表明,RAPA 属T 细胞晚期激活抑制剂，其作用机理在于G1/ S 期交界处干扰Ca2+依赖和Ca2+不依赖的T、B 淋巴细胞活化［9-11］ ，是一种对细胞和体液免疫均有高效抑制作用的免疫抑制剂。RAPA尚可抑制B细胞活化和免疫球蛋白的产生［12］。本实验研究发现，单用RAPA可有效预防小鼠aGVHD,其疗效好于传统预防方案CsA加MTX(P<0.05)。在传统方案CsA加MTX 的基础上加用RAPA时，allo-BMT小鼠的aGVHD 症状及病理分级均较单用RAPA组或CsA加MTX组减轻。RAPA与CsA加MTX联用时的MST 优于RAPA 单用组，且与CsA加MTX方案比较,差异有显著性(P<0.05)。

    另外本实验血常规检查结果提示,适当剂量的RAPA对骨髓植入和造血恢复没有影响,可以在移植早期应用,与国外相关实验结果［13］一致。

    Blaha［13］研究表明，RAPA与其他传统免疫抑制药物合用以后可降低移植前全身照射的量，同时移植物更易存活，移植风险可显著降低，移植后的恢复可相对加快。此发现值得进一步研究，也将使RAPA在临床的应用前景越来越好。

【】
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