褪黑素增强HeLa细胞的抗氧化作用

【摘要】  目的 探讨褪黑素在抑制HeLa细胞增殖剂量下对抗氧化作用的影响。 方法 MTT法测定褪黑素对HeLa细胞增殖的抑制作用;分光光度法检测褪黑素作用下总抗氧化能力(T-AOC),测定谷胱甘肽(GSH)及总超氧化物歧化酶(T-SOD)的含量。 结果 褪黑素对HeLa细胞的抑制作用存在明显的浓度及时间依赖性;褪黑素作用72 h抑制HeLa细胞增殖的IC50为0.27 mmol/L;褪黑素剂量依赖性增强T-AOC;也增加GSH及T-SOD的含量。 结论 褪黑素在抑制HeLa细胞增殖剂量下可增强抗氧化作用。

【关键词】  褪黑素; HeLa细胞; 细胞增殖; 分光光度法,紫外线; 氧化还原; 肿瘤细胞,培养的

    ABSTRACT:  Objective  To investigate the antioxidant effects of melatonin on HeLa cells proliferate activities.  Methods  MTT assay was used to evaluate the inhibitory activities of melatonin on HeLa cells.  Ultraviolet-visible spectrophotometer was used to detect the total antioxidation capacity(T-AOC), the level of glutathione(GSH) and total superoxide dismutase(T-SOD).  Results  The anti-proliferate activities of melatonin on HeLa cells were showed at a time-dependent and a dose-dependent manner.  The IC50 of melatonin on HeLa cells was 0.27 mmol/L.  Melatonin enhanced the T-AOC with dose dependent, the level of GSH, T-SOD was increased also.  Conclusion  Melatonin enhanced the antioxidant effects at a dose dependence of anti-proliferate activities of it.

    KEY WORDS:  melatonin; HeLa cells; cell proliferation; spectrophotometry,ultraviolet; oxidation reduction; tumor cells,cultured

    褪黑素(melatonin,MT)是一种主要由松果腺细胞合成和分泌的吲哚类激素,已有调节睡眠的MT制剂应用于市场［1］。MT作为体内的天然抑瘤因素,其抗肿瘤机制可能与直接抑制肿瘤增殖、免疫增强作用及抗氧化作用有关［2-4］。MT毒副作用相对小,且可减少其他抗肿瘤药的毒性［5-6］,已成为研究的热点之一。本课题组对褪黑素的体内外抗肿瘤作用研究已有报道［7-10］。笔者探讨褪黑素在抑制HeLa细胞增殖剂量下对抗氧化作用的影响。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  主要试剂与设备  MT(美国Sigma公司),临用时先用无水乙醇溶解,再用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液稀释成所需的浓度,无水乙醇的终浓度≤1%。RPMI 1640培养液(美国Gibco公司)。胰蛋白酶(美国Difco公司，进口分装)。小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),56 ℃灭活30 min后使用。四甲基偶氮唑盐(MTT,美国Sigma公司)。总抗氧化能力(T-AOC)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。紫外-可见分光光度计(752型,上海精科实业有限公司)。

    1.1.2  细胞株及培养条件  人宫颈癌HeLa细胞(上海院细胞库),用含10％小牛血清及800 U/mL庆大霉素的RPMI 1640培养液培养,经0.25%胰蛋白酶消化传代,取对数生长期细胞用于实验。

    1.2  方法

    1.2.1  MTT法观察褪黑素对细胞增殖的影响  取对数生长期的HeLa细胞,以0.25%胰蛋白酶充分消化后,用培养液稀释使细胞密度为(1.5～2.5)×104mL-1后接种于96孔培养板中,每孔180 μL。实验组分为低、中、高及极高剂量组(终浓度分别为0.03,0.17,0.86及4.31 mmol/L),各组每孔分别加入等体积相应浓度的MT 20 μL,对照组加入等体积培养液,含与最高浓度药液等体积的无水乙醇,无水乙醇最高终浓度≤1%。每组设4个复孔,培养1～5 d。药液作用1 d后开始,每天同一时间取其中一96孔板,每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL,在培养箱中继续孵育4 h后,弃净上清液,每孔加DMSO 150 μL,空白对照孔加入DMSO 150 μL。振荡10 min;用酶标仪测定光密度［D(492 nm)］,细胞生长抑制率,Bliss法计算IC50。

    1.2.2  紫外-可见分光光度法检测褪黑素对HeLa细胞T-AOC及T-SOD、GSH含量的影响   取对数生长期的HeLa细胞,以0.25%胰蛋白酶充分消化后,用培养液稀释至细胞密度为(6～10)×105 mL-1后接种于6孔培养板中,每孔2 mL。实验组分为低、中、高及／或极高剂量组(终浓度分别为0.17,0.86,4.31及/或21.6 mmol/L)，每组设1块6孔培养板,各组每孔分别加入等体积相应浓度的MT 20 μL,对照组加入等体积培养液,含与最高浓度药液等体积的无水乙醇,无水乙醇最高终浓度≤1%。分别培养24,48及72 h,重复3次。

    1.2.2.1  T-AOC测定  参照［11］方法。取上述培养的各组HeLa细胞,用0.25%胰蛋白酶消化,离心,弃上清液,PBS洗2次,用生理盐水制备成107 mL-1细胞悬液,超声粉碎仪破碎细胞,不离心,在加样前摇匀后取样,每管样品量50 μL。考马斯亮蓝法测定光密度值［D(595 nm)］,计算样品蛋白含量。分光光度计测各管光密度［D(520 nm)］，计算T-AOC。

    1.2.2.2  GSH测定  参照文献［12,13］方法。细胞培养、加药、收集处理细胞同1.2.2.1。分光光度计测定各管光密度［D(412 nm)］。计算HeLa细胞悬液的GSH含量。

    1.2.2.3  T-SOD测定  参照文献［12,13］方法。细胞培养、加药、收集处理细胞同1.2.2.1。分光光度计测各管光密度［D(550 nm)］。计算HeLa细胞悬液的T-SOD活力。

    1.3  统计学处理  实验数据以x±s表示,应用SPSS 12.0统计软件进行单因数方差分析及SNK法分析。

    2  结  果

    2.1  MT对HeLa细胞增殖的影响  极低剂量～高剂量组MT作用于HeLa细胞(12,36,60,84和108 h),随着MT浓度增加、作用时间延长,对HeLa细胞的抑制作用增强,存在明显的浓度-时间依赖性。MT作用72 h抑制HeLa细胞增殖的IC50为0.27 mmol/L(图1)。

    图1  褪黑素对HeLa细胞增殖活性的抑制作用(MTT)

    Fig 1  Anti-proliferate activities of melatonin on HeLa cells by MTT assay

    2.2  MT对HeLa细胞T-AOC及T-SOD、GSH含量的影响

    2.2.1  T-AOC  MT作用于HeLa细胞24,48,72 h后,低、中、高及极高剂量组T-AOC与对照组比较,差别有统计学意义(P<0.05,表1)。随着MT浓度增加,作用时间延长,T-AOC作用增强,以极高剂量组作用72 h为最明显。

    2.2.2  GSH  MT作用于HeLa细胞24,48,72 h后,低、中及高剂量组GSH与对照组比较,除低剂量组作用24 h外均有增加,差别有统计学意义(P<0.05,表2),提示低、高剂量组存在时间依赖性。

   

 2.2.3  T-SOD  MT作用于HeLa细胞24,48 及72 h后, 低、中、高及极高剂量组T-SOD与对照组比较均有增加,差别有统计学意义(P<0.05,表3),但不存在明显的时间与剂量依赖性。表1  褪黑素对HeLa细胞总抗氧化能力的影响 各组在各时间点两两比较.  与对照组比较,☆:P<0.05;与低剂量组比较,△:P<0.05; 与中剂量组比较,#:P<0.05; 与高剂量组比较,▲:P<0.05. 表2  褪黑素对HeLa细胞谷胱甘肽的影响各组在各时间点两两比较.  与对照组比较,☆:P<0.05;与低剂量组比较,△:P<0.05; 与中剂量组比较,#:P<0.05.表3  褪黑素对HeLa细胞总超氧化物歧化酶的影响 各组在各时间点两两比较.  与对照组比较,☆:P<0.05;与低剂量组比较,△:P<0.05; 与中剂量组比较,#:P<0.05; 与高剂量组比较,▲:P<0.05.

    3  讨  论

    3.1  氧自由基与肿瘤的关系及褪黑素的抗氧化作用  在肿瘤形成和生长过程中自由基含量的变化是复杂的。肿瘤形成初期自由基的含量急速增加,当肿瘤生长到一定大小时该含量达到最大值,肿瘤组织坏死缺氧时含量则下降［14］。关于自由基和癌症关系的研究报道很多,争论也很多。超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)是具有清除自由基和活性氧、分解过氧化物等作用的两种机体主要的抗氧化酶。GSH是GSH-PX的底物,可清除O2-·、H2O2及LOOH,也可稳定含巯基的酶和防止血红蛋白及其他辅因子受氧化损伤。有报道表明MT在机体内可激活GSH-PX,催化GSH的氧化过程,同时将H2O2分解为H2O,消除氢氧自由基(·OH),缓解肿瘤的［15］,本文结果表明,MT在0.17,0.86,4.31及21.6 mmol/L水平可提高肿瘤细胞内SOD及GSH含量,与上述相似。

    3.2  褪黑素抑制HeLa细胞增殖与其增强抗氧化作用的关系  MT对体外培养肿瘤细胞抗氧化能力的影响已有报道［16］。本文结果表明,MT对HeLa细胞的抑制作用存在明显的浓度及时间依赖性。MT在抑制肿瘤细胞增殖的剂量下,可剂量依赖性增强T-AOC,同时增加GSH及T-SOD含量,后者可能是导致细胞内T-AOC升高的主要原因。有报道显示，从肿瘤形成初期到肿瘤生长期自由基含量逐渐增加［14］, 因此,T-AOC的增强可能参与MT对HeLa细胞增殖的某一阶段的抑制效应,但需实验进一步证实。本研究为MT用于肿瘤临床的辅助提供理论依据。

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