人参皂苷Rg1通过CDK5途径减轻Aβ25-35诱导的神经元tau蛋白磷酸化

【摘要】  目的 探讨在Aβ25-35诱导的皮层神经元tau蛋白过度磷酸化中,人参皂苷Rg1对tau蛋白过度磷酸化及周期依赖性蛋白激酶5(CDK5)的激动亚基p35的影响。 方法 通过蛋白免疫印迹法检测胎鼠皮层神经元CDK5的两个亚基cdk5和p35/p25的蛋白水平,以及CDK5的磷酸化底物tau蛋白在Thr205和Ser404位点的磷酸化水平。 结果 凝聚态Aβ25-35(20 μmol/L)作用于皮层神经元12 h,皮层神经元中p35裂解成p25的数量增多,tau蛋白在Thr205和Ser404位点的磷酸化水平增高,对cdk5亚基表达水平的影响不明显。人参皂苷Rg1和calpain特异性抑制剂calpeptin可稳定皮层神经元的p35蛋白,减少p25生成,人参皂苷Rg1和CDK5特异性抑制剂roscovitine可减轻凝聚态Aβ25-35诱导的皮层神经元tau蛋白过度磷酸化。 结论 CDK5可能参与人参皂苷Rg1减轻寡聚态Aβ25-35诱导的皮层神经元tau蛋白过度磷酸化。

【关键词】  人参皂苷; 淀粉样蛋白; tau蛋白质类; 磷酰化; 神经元; 细胞周期蛋白质依赖激酶类;印记法,蛋白质

    ABSTRACT:  Objective  To explore the effect of ginsenoside Rg1 on cyclin-dependent kinase 5 activator p35 in the process of β-amyloid peptide 25-35-induced tau hyperphosporylation.  Methods  The levels of cyclin-dependent kinase 5 activator-p35/p25, cdk5 and tau phosphorylation in the site of Thr205, Ser404 were detected by Western blot.  Results  After exposure to Aβ25-35(20 μmol/L) for 12 h, the levels of p25 and p25/p35 were increased, but the expression of cdk5 has not markedly changed.  Meanwhile, the levels of tau protein phosphorylation in the sites of Thr205 and Ser404 were also enhanced.  After pretreatment with ginsenoside Rg1 or calpeptin, a specific inhibitor of calpain, the levels of p25 and p25/p35 were decreased.  After pretreatment with ginsenoside Rg1 or roscovitine, a specific inhibitor of CDK5, tau hyperphosphorylation induced by Aβ25-35 reduced.  Conclusion  Cyclin- dependent kinase 5 may be involved in ginsenoside Rg1 attenuating fibrillar Aβ25-35-induced tau hyperphosporylation in cortical neurons.

    KEY WORDS:  ginsenoside; amyloid beta-protein; tau proteins; phosphorylation; neurons; cyclin-dependent kinase; blotting,Western

    阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以老年斑、神经原纤维缠结和神经元缺失为主要病理特征的慢性、进行性神经系统退行性疾病。AD的重要病理改变之一神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)的形成与tau蛋白过度磷酸化密切相关,且NFT的数量与AD患者痴呆程度呈正相关［1］。周期依赖性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5,CDK5)是细胞周期素依赖性蛋白激酶家族成员,是tau蛋白磷酸化的关键性蛋白激酶之一。CDK5参与AD早期神经原纤维缠结形成的病理过程［2］。cdk5亚基和其激活的蛋白结合形成CDK5才能发挥激酶活性。在CDK5的激活蛋白中,对p35的研究居多、且也较为清楚。人参皂苷Rg1是人参的主要活性成分之一,有研究发现人参皂苷Rg1对多种实验动物模型的学习记忆障碍均有明显改善作用,可提高正常动物模型的学习记忆能力［3］。本实验室前期研究发现,Rg1可通过抑制糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)和增加PP-2A活性来减轻Aβ25-35诱导的tau蛋白过度磷酸化,但是CDK5是否参与Rg1减轻Aβ25-35诱导的tau蛋白的过度磷酸化？笔者以20 μmol/L的凝聚态Aβ25-35作用于胎鼠皮层神经元,建立tau蛋白过度磷酸化细胞模型［4］,观察Rg1对CDK5作用的tau蛋白主要磷酸位点的磷酸化情况、p35以及cdk5亚基的影响,为Rg1应用于防治AD病提供必要的实验依据和理论基础。

    1  材料与方法

    1.1  材料  人参皂苷Rg1（吉林大学基础医学院有机化学教研室,纯度>98％）；Aβ25-35(美国Sigma公司)；roscovitine(美国Alexis公司)；DMEM-F12培养基、胰酶、10×Hanks平衡盐溶液、左旋多聚赖氨酸、N2添加剂(美国Gibco公司)；胎牛血清(杭州江滨生物技术有限公司)。基础培养基:DMEM-F12、NaHCO3(2 g/L)、青霉素G(0.1 IU/L)、链霉素(0.1 IU/L)和HEPES(1.19 g/L)。完全培养基:基础培养基＋N2添加剂＋10％胎牛血清。无血清培养基:基础培养基＋N2添加剂(DMEM-F12∶N2＝1∶1)。β-actin和cdk5单克隆抗体(美国NeoMarkers公司)；Tau［pT205］、Tau［pS404］多克隆抗体(美国Biosource公司)；p35/p25(C-19)多克隆抗体(美国Santa Cruz公司);Western Blot化学发光检测试剂盒(美国KPL公司)。

    1.2  方法

    1.2.1  皮层神经元原代培养  参照［5］。孕期(18±2)d的SD大鼠(上海西普尔必凯实验动物有限公司)。在无菌条件下取出胎鼠,解剖分离大脑皮层,分散细胞,以每孔约2.5×106个细胞密度接种于预先涂有左旋多聚赖氨酸的6孔板,加入完全培养基,在37 ℃,体积分数为0.05的CO2、饱和湿度的培养箱中培养3 d,然后换上无血清培养基继续培养3 d,以抑制胶质细胞生长。第7天收集细胞。

    1.2.2  药物干预及分组  用超纯水将冻干的Aβ25-35溶解,配成1 mmol/L储存液,于-20 ℃保存,临用前于37 ℃放置4 h使其凝聚。(1)对照组:不加任何处理因素;(2)模型组:凝聚态Aβ25-35(20 μmol/L)作用于皮层神经元12 h;(3)calpeptin预处理组:calpeptin［6］(20 μmol/L)作用24 h加入凝聚态Aβ25-35(20 μmol/L)共同作用于皮层神经元12 h;(4)roscovitine预处理组:roscovitine［7］(0.16 μmol/L)作用24 h加入20 μmol/L凝聚态Aβ25-35共同作用于皮层神经元12 h;(5)Rg1预处理组:人参皂苷Rg1(20 μmol/L)预处理24 h,加入凝聚态Aβ25-35(20 μmol/L)作用于皮层神经元12 h。

    1.2.3  检测cdk5、p35/p25和tau蛋白磷酸化水平  将待收集细胞的培养液吸弃,用预冷的磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗2次,每孔加入细胞裂解液,冰面上裂解20 min,14 000×g,4 ℃离心10 min,吸上清液,Protein Assay法（Bio-rad）进行蛋白定量。以10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,半干电转移法转膜,室温下用封闭液封闭1 h后加入用封闭液稀释的一抗(cdk5［1∶1 000稀释］单克隆抗体、p35/p25(C-19)多克隆抗体［1∶500稀释］、Tau［pT205］和Tau［pS404］多克隆抗体［1∶1 000稀释］),4 ℃孵育过夜,抗兔或鼠IgG二抗(1∶1 000稀释)反应2 h,化学发光法显色,X射线底片曝光。β-actin作为内参照。实验重复3次。

    1.3  统计学处理  测定结果以x±s表示,采用SPSS 12.0软件包分析,组间比较用单因素方差分析。

    2  结  果

    2.1  人参皂苷Rg1对皮层神经元cdk5和p35/p25水平的影响  模型组p25蛋白水平以及p25/p35的比值明显比对照组增高,而cdk5的蛋白水平与对照组比较变化不大,提示凝聚态Aβ25-35可促进p35降解成p25,对cdk5亚基的影响不大。中性蛋白酶calpain特异性抑制剂calpeptin预处理组,p25的水平和p25/p35的比值与对照组相似,但比模型组低,说明calpeptin可以抑制凝聚态Aβ25-35诱导的p35降解成p25。20 μmol/L Rg1预处理组中cdk5亚基表达水平变化不大,而p25的蛋白水平和p25/p35的比值均比模型组低,说明Rg1与calpeptin作用相似，也能抑制凝聚态Aβ25-35诱导的p35降解成p25(图1)。

    与Aβ25-35组比较,☆:P<0.05.

    图1  人参皂苷Rg1对p25和p25/p35水平的影响

    Fig 1  Effect of ginsenoside Rg1 on the levels of p25 and p25/p35

    2.2  人参皂苷Rg1对Aβ25-35诱导的皮层神经元tau蛋白磷酸化的影响  模型组tau蛋白在Thr205、Ser404位点的磷酸化水平明显高于对照组,提示凝聚态Aβ25-35可使皮层神经元tau蛋白磷酸化水平增加。CDK5特异性抑制剂roscovitine预处理组和20 μmol/L浓度的Rg1预处理组tau蛋白磷酸化水平皆比模型组低。一定剂量的人参皂苷Rg1和CDK5特异性抑制剂roscovitine一样,具有抑制和/或减轻凝聚态Aβ诱导的皮层神经元tau蛋白过度磷酸化的作用(图2)。

    3.1  tau蛋白过度磷酸化在AD发病过程中的作用  细胞内外的β-淀粉样蛋白沉积和细胞内的神经原纤维缠结形成是AD的两个特征性病理改变,前者是由APP的代谢异常形成的,而后者主要由双螺旋丝(paired helical filaments, PHF)组成,而过度磷酸化的tau蛋白是PHF的主要亚单位。tau蛋白过度磷酸化可导致微管功能丧失,是AD分子病理的重要环节。正常情况下,tau蛋白与管蛋白(tubulin)结合成为微管蛋白参与各种生理活动。而过度磷酸化的tau蛋白可与正常tau蛋白竞争性结合管蛋白,从而阻断微管蛋白的组装,抑制微管聚集,使微管解体及细胞骨架破坏。AD病人大脑中tau蛋白过磷酸化是由于体内蛋白激酶和蛋白磷酸酶系统与Aβ25-35组比较,☆:P<0.05.

    图2  人参皂苷Rg1对Aβ25-35诱导的皮层神经元tau蛋白磷酸化的影响

    Fig 2  Effect of ginsenoside Rg1 on tau phosphorylation induced by Aβ25-35

    失衡所致。其中GSK-3β、CDK5和丝裂原活化的蛋白激酶(miotgen-activated protein kinase,MAPK)是tau蛋白磷酸化的3种关键性蛋白激酶。

    3.2  Aβ25-35通过p25/cdk5途径诱导tau蛋白过度磷酸化  CDK5是引起tau蛋白磷酸化的重要的蛋白激酶，由无酶活性的cdk5亚基与激活蛋白(neuronal cdk5 activator,Nck5a)结合后构成cdk5-Nck5a-ATP复合物才有生物学活性［8］,有多种调节蛋白参与此过程,其中以p35的作用最为重要。在一些损伤因素(如Aβ)的作用下,p35可经中性蛋白酶(calpain)作用,降解为p25［5］,从而更大地发挥激活CDK5的作用。p35是不稳定蛋白,通过泛素-蛋白途径代谢失活,然而p25要比p35稳定,其半衰期是p35的5～10倍。此外,p25缺少p35具有的膜锚定信号基序,故p25胞内分布限制较p35为少。所以p25/cdk5可以无节制地磷酸化其底物（如tau蛋白）,从而引发神经退行性改变和神经纤维缠结形成的病理改变［9］。笔者采用凝聚态Aβ25-35诱导体外培养的皮层神经元,促进p35降解成p25,使得p25的蛋白水平和p25/p35的比值增加,与［5］等报道一致。同时,经凝聚态Aβ25-35作用后,CDK5活性增强,tau蛋白在Thr205和Ser404等位点的磷酸化水平明显增高,这也同Zhen和Li等的研究结果一致［10-11］。

    3.3  CDK5在人参皂苷Rg1减轻Aβ25-35诱导的tau蛋白磷酸化的作用  人参皂苷Rg1是人参的主要活性成分之一,有研究发现人参皂苷Rg1对多种实验动物模型的学习记忆障碍均有明显改善作用,可提高正常动物模型的学习记忆能力［12-14］。曾育琦等研究发现，Rg1可抑制凝聚态的Aβ25-35激活GSK-3β的作用,减轻Aβ25-35诱导的tau蛋白在Ser199/202、Thr231和Ser396位点过度磷酸化(待发表)。本实验则是以CDK5为出发点研究Rg1对Aβ25-35诱导的CDK5激酶影响和相应tau蛋白磷酸化情况,结果表明，Rg1具有与CDK5特异性抑制剂相似的作用,能减轻tau蛋白在Thr205和Ser404位点的磷酸化水平。同时Rg1与中性蛋白酶(calpain)的抑制剂calpeptin具有相似的作用,即可降低凝聚态的Aβ25-35对p35的降解、降低p25水平。由此可见,Rg1减轻tau蛋白磷酸化的作用是通过多种途径实现的。有关Rg1是否对calpain的上游调控因素和微管动力学进行调节以及如何进行调节,尚待进一步研究。

【文献】
  ［1］ Arriagada P V,Growdon J H,Hedley-Whyte E T,et al. Neurofibrillary tangles but not senile plaques parallel duration and severity of Alzheimer’s disease［J］. Neurology, 1992,42(3 Pt 1):631-639.

［2］ Augustinack J C,Sanders J L,Tsai L H,et al. Colocalization and fluorescence resonance energy transfer between cdk5 and AT8 suggests a close association in pre-neurofibrillary tangles and neurofibrillary tangles［J］. J Neuropathol Exp Neurol, 2002,61(6):557-564.

［3］ Zhang J T,Qu Z W,Liu Y,et al. Preliminary study on antiamnestic mechanism of ginsenoside Rg1 and Rb1［J］. Chin Med J, 1990,103(11):932-938.

［4］ 曾育琦,陈晓春,黄 春,等. β淀粉样蛋白25-35诱导皮质神经元tau蛋白过度磷酸化［J］. 中华神经科杂志, 2005,38(10):659-660.

［5］ 陈丽敏,陈晓春,林挺岩,等. 大鼠皮质神经元的体外培养和纯化［J］. 福建医科大学学报, 2002,36(3):239-241.

［6］ Lee M S,Kwon Y T,Li M W,et al. Neurotoxicity induces cleavage of p35 to p25 by calpain［J］. Nature, 2000,405(18):360-364.

［7］ Walter F A,Renato T G,Fernanda C,et al. Molecular model of cyclin-dependent kinase 5 complexed with roscovitine［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2002,297(5):1154-1158.

［8］ Chou K C,Watenpaugh K D,Heinrikson R L. A model of complex between cyclin-dependent kinase 5 and the activation domain of neuronal Cdk5 activator［J］. Biochem Biophy Res Comm, 1999,259(2):420-428.

［9］ Cruz J C,Tseng H C,Goldman J A,et al. Aberrant Cdk5 activation by p25 yriggers pathological events leading to neurodegeneration and neurofibrillary tangles［J］. Neuron, 2003,40(3):471-483.

［10］ Zheng Y L,Kesavapany S,Gravell M,et al. A CDK5 inhibitory peptide reduces tau hyperphosphorylation and apoptosis in neurons［J］. Eur Mole Bio Organ, 2005,24 (1):209-220.

［11］ Liu F,Iqbal K,Grundke-Iqbal I,et al. Involvement of aberrant glycosylation in phosphorylation of tau by cdk5 and GSK-3β［J］. Feder Eur Bioch Soc Lett, 2002,530(1-3):209-214.

［12］ Lee T F,Shiao Y J,Chen C F,et al. Effect of ginseng saponins on beta-amyloid-suppressed acetylcholine release fromrat hippocampal slices［J］. Planta Med, 2001,67(7):634-63.

［13］ 张均田,刘 云,屈志炜,等. 人参皂甙Rb1和Rg1对小鼠中枢神经递质和脑内蛋白质合成的影响［J］. 药学学报, 1988,23(1):12-16.

［14］ Salin K N,McEwen B S,Chao H M,et al. Ginsenoside Rb1 regulates ChAT,NGF and trKA mRNA expression in the rat brain［J］. Brain Res Mol Brain Res, 1997,47(1-2):177-182.