新生鼠脑损伤后神经蛋白聚糖的变化

【摘要】  目的 观察新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后脑内神经蛋白聚糖的动态变化,探讨神经可塑性相关抑制因素在发育期脑损伤后的改变。 方法 7 d龄SD大鼠随机分为假手术组和HIBD组,于脑缺氧缺血术后1,4,7,14,28 d分别取脑组织进行H-E染色和免疫组织化学染色观察组织病理变化及神经蛋白聚糖蛋白表达,并以RT-PCR法检测其mRNA表达。 结果 假手术组神经蛋白聚糖的表达于术后7 d达到高峰(P<0.05),此后阳性表达逐渐减少;HIBD组术后4 d、7 d的神经蛋白聚糖蛋白及其mRNA表达均低于假手术组(P<0.05),至术后14 d、28 d表达增高,均高于假手术组(P<0.05)。 结论 新生大鼠HIBD后脑组织神经蛋白聚糖蛋白及其mRNA表达随着时间推移发生变化,提示HIBD后神经可塑性调控的关键时期为损伤后2周内。

【关键词】  缺氧缺血,脑; 蛋白聚糖类; 大鼠; 软骨素硫酸盐类; 动物,新生; 疾病模型,动物

    ABSTRACT:  Objective  To observe the change of neurocan in neonatal rat brains after hypoxia-ischemia brain damage(HIBD), and explore the change of inhibitory factors neuronal plasticity associated with neonatal brain damage.  Methods  7 days neonate SD rats were randomly divided into sham-operated group and HIBD group.  Then at 1, 4, 7, 14, 28 days after the operation, dissect the brain and the expression of neurocan was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) and immunohistochemical method respectively.  Results  The amount of neurocan reached a peak level after 7 days of the operation in sham-operated brains(P<0.05), then reduced.  Expression of neurocan in HIBD brains at 4, 7 days after the operation was lower than that of sham-operated brains(P<0.05), while was higher than that of sham-operated brains at 14, 28 days after the operation(P<0.05).  Conclusion  The expression of neurocan is different in the progress of neonatal HIBD and the best time for controlling neuronal plasticity associated inhibitory factors is within two weeks.

    KEY WORDS:  hypoxia-ischemia brain; proteoglycans; rats; chondroitin sulfates; animal,newborn; disease models,animal

    新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是儿童神经系统伤残的常见原因,存活者常遗留智力低下、脑性瘫痪等神经系统后遗症。虽然脑损伤神经本身具有可塑性,但由于受到环境因素和抑制因素的影响,其再生往往不如周围神经容易。近来研究发现，神经蛋白聚糖是影响脑损伤神经可塑性的一种抑制蛋白,但其在发育期脑损伤中变化的报道少见。本实验模拟新生儿HIBD建立动物模型,观察损伤后不同时间段神经蛋白聚糖的表达,探讨脑神经可塑性相关抑制因素在发育期脑损伤后的改变,为指导发病后促进脑神经修复的临床提供实验依据。

    1  材料与方法

    1.1  动物分组及HIBD模型建立  选择新生7 d龄健康SD大鼠(福建省医学研究所),雌雄不限,体质量11～17 g。按1∶1 随机分为HIBD组和假手术组,参照［1］方法建立缺氧缺血模型。用1%水合氯醛腹腔注射麻醉,颈部常规消毒作正中切口,HIBD组分离出左侧颈总动脉后永久性结扎并剪断血管,缝合切口后放入37 ℃恒温水浴密闭缺氧箱内,通入含8%氧气和92%氮气的混合气体(福州江航气体有限公司)2 h,术后取夹尾左旋者进入实验。假手术组术中分离出左颈总动脉后不进行结扎直接缝合切口并不作缺氧处理。假手术组、HIBD组又根据术后处死时间再随机分为术后1,4,7,14,28 d组,各组术后均返回母鼠身边继续哺乳喂养。

    1.2  脑组织切片及病理观察  各组分别于术后1,4,7,14,28 d用水合氯醛腹腔注射麻醉,心脏灌注内固定后开颅取脑,沿中脑前1/3切取厚约3 mm的脑片,置于4%多聚甲醛(pH 7.4)中4 ℃外固定过夜。常规脱水、透明、石蜡包埋，连续冠状切片,厚度约为3～5 μm,H-E染色。

    1.3  神经蛋白聚糖免疫组织化学染色  切片常规脱蜡、梯度酒精至水化,3%H2O2孵育15 min以阻断内源性过氧化物酶活性,高温高压修复1.5 min后,加小鼠抗大鼠神经蛋白聚糖单克隆抗体(1 mg/mL,美国Chemicon公司)25 ℃孵育2 h;其余操作按辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠多克隆抗体两步法试剂盒(北京中杉生物技术公司)说明进行,DAB显色后用苏木精对比染色,常规封固、镜检。以PBS代替一抗作为阴性对照。每只大鼠分别取脑组织切片3张,每张切片选择细胞分布均匀的高倍(×400)视野3个进行图像分析,检测神经蛋白聚糖免疫阳性产物的面积、累积光密度值(integrated optical density,IOD)以及观察区背景的光密度值(optical density,OD),出各视野神经蛋白聚糖免疫阳性产物的校正累积光密度(correct integrated optical density,CIOD)。按公式计算:

    神经蛋白聚糖免疫阳性产物CIOD=神经蛋白聚糖免疫阳性产物IOD-观察区背景OD值×阳性区域面积

    1.4  RT-PCR检测神经蛋白聚糖 mRNA  利用Trizol一步法(美国Invitrogen公司)提取损伤侧大脑皮质及海马组织总RNA,取RNA 1 μg进行逆转录(逆转录试剂盒,美国Ferments公司)合成cDNA。取cDNA 1 μL作模板,用神经蛋白聚糖特异性引物［2］:

    正链：5’-AGGAGCCAGCTCCAGTATGG-3’

    负链：5’-TTGGCTCTGTGCCGGGGATA-3’

    产物378 bp,大鼠内参磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH特异性引物(产物575 bp)行PCR(MyCycler PCR仪,美国BIO-RAD):预变性95 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min→60 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s,32个循环。取PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳(DYY-Ⅲ8A稳压稳流定时电泳仪,北京六一仪器厂),采用图像分析系统(JS-380A自动凝胶图像分析仪,上海培清科技有限公司)进行阳性条带灰度值分析,以GAPDH条带作为内参照,结果以神经蛋白聚糖灰度值/GAPDH 灰度值表示。

    1.5  统计学处理  结果以x±s表示,应用SPSS 11.5软件进行统计分析。多样本均数比较采用单因素方差分析、两样本均数比较采用t 检验,P <0.05为差别有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  脑组织病改变  HIBD组术后1 d脑组织病变不明显;4 d左侧大脑组织出现大片坏死,细胞溶解、消失,可见“鬼影细胞”;7 d病灶周围出现胶质细胞增生,病灶中心仍可见大量固缩核和核碎片;14 d病灶中心仅见少量的固缩核和核碎片,周围增生的胶质细胞较术后7 d增多,形成胶质瘢痕;28 d神经元大量丢失,皮层、纹状体、海马等部位均出现胶质瘢痕。假手术组双侧脑组织结构层次清晰,细胞轮廓正常,核居中,核仁清楚,尼氏体均匀分布于核的周边(图1)。

    2.2  脑组织神经蛋白聚糖的表达  脑组织神经蛋白聚糖的表达情况见表1。神经蛋白聚糖免疫阳性物呈棕褐色,分布于神经元细胞质内。假手术组术后1 d阳性细胞量相对较少,免疫阳性产物着色较淡;术后4 d阳性细胞及免疫阳性产物表达量均较前有所增加;7 d大量阳性细胞表达,免疫阳性产物着色深;14 d阳性表达减少;28 d仅可见微弱的阳性表达。HIBD组术后1 d阳性细胞表达量接近同期假手术组;4,7 d阳性细胞量则较假手术组减少,免疫阳性产物着色较淡;14 d出现神经蛋白聚糖高表达,阳性细胞主要位于损伤区大脑皮层及海马处,阳性细胞细胞质内密集免疫阳性产物,该高表达持续至28 d(图2)。

 

   2.3  脑组织神经蛋白聚糖 mRNA的表达  脑组织神经蛋白聚糖 mRNA表达情况见表2。假手术组术后1 d阳性条带较弱,4，7 d阳性条带明显增亮,14，28 d阳性条带较前减弱。HIBD组术后1 d条带模糊,4，7 d阳性条带弱于同期假手术组,14，28 d神经蛋白聚糖 mRNA表达强于同期假手术组(图3)。

    HIBD:缺氧缺血性脑损伤.  A:假手术组； B～D:HIBD组; A:脑组织结构层次清晰,细胞轮廓正常,核居中,核仁清楚； B:术后4 d,左侧大脑大片坏死,细胞溶解、消失,可见“鬼影细胞”; C:7 d胶质细胞增生,细胞核固缩、破裂; D:14 d胶质细胞大量增生形成胶质瘢痕.表1  大鼠脑组织神经蛋白聚糖免疫组织化学阳性产物校正累积光密度 n＝5.  HIBD:缺氧缺血性脑损伤.  与假手术组术后其他时间比较,☆:P<0.05; 与同期假手术组比较,△:P<0.05.

    HIBD:缺氧缺血性脑损伤.  A,B:假手术组; C,D:HIBD组.  A:术后7 d大量免疫阳性产物呈棕褐色沉积在阳性细胞质; B:14 d阳性细胞少,免疫阳性产物着色变淡； C:术后7 d阳性细胞量少,免疫阳性产物呈浅褐色分布于神经细胞质; D:14 d损伤区大脑皮层及海马处出现密集棕褐色免疫阳性产物,阳性细胞较多. 表2  大鼠脑组织神经蛋白聚糖 mRNA阳性条带灰度的相对比值

    3  讨  论

    3.1  神经蛋白聚糖与神经可塑性的关系  神经可塑性是指中枢神经系统在形态结构和功能活动上的可修饰性,在脑发育过程中或神经系统遭受损伤后,脑组织通过损伤轴突的再生及神经连接的重建可实现对整个神经回路的修饰。新生儿HIBD既是处于脑组织发育期又是脑组织的损伤性疾病,因此其在损伤后可塑性的变化具有特殊性。

    脑损伤神经虽具有可塑性,但由于受到环境因素和抑制因素的影响,脑神经的再生往往不如周围神经的再生容易。近来国外越来越多的研究从影响神经可塑性的抑制因素入手,以求控制抑制因素来促进损伤神经的修复。神经蛋白聚糖就是抑制性细胞外环境中由胶质瘢痕的胶质细胞产生的一种轴突生长抑制蛋白［3］。

    神经蛋白聚糖是硫酸软骨素蛋白聚糖(chondroitin sulfate proteoglycans,CSPG) 可聚蛋白聚糖家族中的一种,只存在于正常发育期脑组织中,成年期当脑组织损伤后其表达量发生变化,并通过其CS链与细胞黏附分子Ng-CAM/L1、N-CAM、多效蛋白/肝素结合生长相关因子(PTN/HB-CAM)、两性聚糖等相结合以及通过其核心蛋白与韧黏聚糖(tenasic-C和tenascin-R)、TAG-1/轴突蛋白-1等相结合来调节神经细胞间的连接、抑制神经轴突的再生长,同时也影响了再生轴突延伸到远侧端建立特异性的功能联系。Matsui等在化学性诱导癫痫发作引起的脑损伤成年鼠脑模型中发现神经蛋白聚糖在脑损伤后表达增高,认为脑损伤后神经蛋白聚糖的聚集可能是脑损伤后神经修复的过程之一,神经蛋白聚糖在脑损伤神经修复过程可以通过抑制神经轴突的外生长消除错误分支,保证轴突生长的方向性［4］。可见,神经蛋白聚糖是影响神经可塑性的一种抑制性蛋白。但是,神经蛋白聚糖在处于发育期脑损伤中的变化尚不明确。

    3.2  神经蛋白聚糖在发育期脑损伤后的表达  本实验以新生7 d龄大鼠建立HIBD动物模型,通过观察神经蛋白聚糖的动态变化来反映神经可塑性相关抑制因素在发育期脑损伤后的变化。免疫组织化学及RT-PCR结果均发现,神经蛋白聚糖及神经蛋白聚糖mRNA在假手术组术后7 d脑组织中表达达到高峰(P<0.05),该结果与Okamoto等在正常发育期脑组织中观察到的结果相符合［5］;HIBD术后1 d 神经蛋白聚糖的表达与假手术组术后1 d差别无显著性(P>0.05),此时病理观察显示脑组织病变尚不明显;而HIBD术后4 d、7 d 神经蛋白聚糖的表达均低于同期假手术组(P<0.05),病理观察可见脑组织病变最为严重、胶质细胞开始增生;该结果与Qi等在新生大鼠脊髓损伤模型中的研究结果一致［6］,但与Deguchi等在短暂性中脑动脉闭塞模型中所发现的神经蛋白聚糖于缺血后4 d达到高峰的结果相反［7］,说明神经蛋白聚糖在发育期脑组织损伤后与成熟脑组织损伤后的表达不同。至HIBD术后14 d、28 d时,神经蛋白聚糖的表达量明显高于同期假手术组(P<0.05),此时在皮层、纹状体、海马等部位病灶中心均可见胶质瘢痕形成。

    神经蛋白聚糖在新生鼠HIBD后之所以有这种表达量的变化可能与其来源有关。神经蛋白聚糖在生理条件下主要由神经元合成,而在脑损伤后神经蛋白聚糖表达明显增加的同时常常伴随有星形胶质细胞所表达的胶质纤维酸性蛋白增多,说明脑损伤后神经蛋白聚糖主要由星形胶质细胞合成［8］。HIBD术后1 d脑组织的病变尚不明显,神经元所合成的神经蛋白聚糖没有显著性变化。至术后4 d、7 d,HIBD引起脑组织弥漫性坏死,神经元的大量丢失导致神经蛋白聚糖的合成减少,而星形胶质细胞代偿性增加所合成的神经蛋白聚糖尚不足以弥补减少的神经蛋白聚糖,引起神经蛋白聚糖的暂时性减少。而到HIBD术后14 d、28 d,星形胶质细胞大量增生,在损伤脑组织周围形成胶质瘢痕,此时神经蛋白聚糖的表达随之增加。神经蛋白聚糖的表达增加在某种程度上可以通过抑制神经轴突的外生长消除错误分支,保证轴突生长的方向性,但由于其抑制轴突的再生长并影响再生轴突延伸到远侧端建立特异性的功能联系,影响了神经的修复过程。可见,发育期脑组织损伤后神经可塑性相关抑制因素随着脑损伤的进展发生变化,神经可塑性调控的关键时期为损伤后2周内。上述研究可望为指导发育期脑损伤神经修复的临床提供依据。

【】
  ［1］ Rice J E,Vannucci R C,Brierley J B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat［J］. Ann Neurol, 1981,9(2):131-141.

［2］ Inatani M,Tanihara H,Oohira A,et al. Upregulated expression of neurocan,a nervous tissue specific proteoglycan,in transient retinal ischemia［J］. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2000,41(9):2748-2754.

［3］ Rhodes K E,Moon L D,Fawcett J W. Inhibiting cell proliferation during formation of the glial scar: effects on axon regeneration in the CNS［J］. Neuroscience, 2003,120(1):41-56.

［4］ Matsui F,Kawashima S,Shuo T,et al. Transient expressed of juvenile-type neurocan by reactive astrocytes in adult rat brains injured by kainite-induced seizures as well as surgical incision［J］. Neuroscience, 2002,112(4):773-781.

［5］ Okamoto M,Sakiyama J,Kurazono S,et al. Developmentally regulated expression of brain-specific chondroitin sulfate proteoglycans,neurocan and phosphacan,in the postnatal rat hippocampus［J］. Cell Tissue Res, 2001,306(2):217-229.

［6］ Qi M L,Wakabayashi Y,Enomoto M,et al. Changes in neurocan expression in the distal spinal cord stump following complete cord transection: a comparison between infant and adult rats［J］. Neurosci Res, 2003,45(2):181-188.

［7］ Deguchi K,Takaishi M,Hayashi T,et al. Expression of neurocan after transient middle cerebral artery occlusion in adult rat brain［J］. Brain Res, 2005,1037(1-2):194-199.

［8］ Schwarzacher S W,Vuksic M,Haas C A,et al. Neuronal hyperactivity induces astrocytic expression of neurocan in the adult rat hippocampus［J］. Glia, 2006,53(7):704-714.