涎腺腺样囊性癌转移细胞株的Notch基因表达

【摘要】  目的 筛选与涎腺腺样囊性癌转移相关的候选基因,并对其进行初步验证。 方法 限制片段差异显示PCR技术(RFDD-PCR)构建涎腺腺样囊性癌高低转移细胞株(ACC-M、ACC-2)基因表达谱,生物信息学分析两个表达谱的Notch基因,半定量RT-PCR技术对两细胞株的Notch基因差异表达进行验证。 结果 用RFDD-PCR方法成功构建涎腺腺样囊性癌高低转移细胞株(ACC-M、ACC-2)的表达谱,共获得5 420个基因片段,其中包含3个Notch基因。半定量RT-PCR证实Notch2、Notch4在ACC-M的表达高于ACC-2,Notch1在两表达谱未见表达,半定量RT-PCR发现其在ACC-M的表达高于ACC-2。Notch3在两个细胞株表达的差别无统计学意义。 结论 Notch1、Notch2、Notch4可能与涎腺腺样囊性癌的发生、、转移有关。

【关键词】  癌,腺样囊性; 涎腺肿瘤; 基因表达谱; 逆转录聚合酶链反应; 基因

    ABSTRACT:  Objective  To screen candidate genes related to cancerometastasis and adenoid cystic carcinoma.  Methods  Restriction fragments differential display PCR(RFDD-PCR) was used to set up gene expression profiles of adenoid cystic carcinoma cell lines-ACC-M and ACC-2 with high and low metastasis potential respectively.  Candidate genes were screened through bioinformatics analysis.  The expression of 4 genes of Notch family was assessed by semi-quantitative RT-PCR.  Results  Two gene expression profiles including 5 420 gene fragments were constructed, 3 genes of Notch family were observed in these two cell lines.  Semi-quantitative RT-PCR identified that 3 gene of Notch were Notch1, Notch2, and Notch4.  Conclusion  Notch1, Notch2, Notch4 may be related to carcinogenesis and metastasis of adenoid cystic carcinoma.

    KEY WORDS:  carcinoma,adenoid cystic; salivary gland neoplasms; gene expression profiling; reverse transcriptase polymerase china reaction; genes

    恶性肿瘤的浸润、转移是一个多因素、多步骤、多基因参与的复杂过程,也是恶性肿瘤患者主要致死原因。近年来研究发现,Notch基因改变与肿瘤、遗传性疾病、神经退行性疾病、心血管病变等多种疾病的发生发展有密切关系。笔者从基因组的整体水平,观察Notch基因在涎腺腺样囊性癌高低转移细胞株间mRNA表达的差异,为临床寻找更为敏感的转移相关指标提供。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  细胞与试剂  人涎腺腺样囊性癌高转移细胞株(ACC-M)和低转移细胞株(ACC-2)由上海第九人民口外肿瘤实验室惠赠。Trizol试剂(美国 Invitrogen公司);第2代差异显示试剂盒/DISPLA YPROFILETM Kits(美国Q-biogene公司);Cy5荧光标记试剂盒(英国Amersham Biosciences公司);Rnase抑制剂、逆转录酶(美国Promaga公司);Taq DNA聚合酶、DL-2000 DNA Marker［宝生物工程(大连)有限公司］;Notch等引物(上海中科开瑞生物芯片科技股份有限公司合成)。

    1.1.2  主要仪器  紫外可见分光光度计(美国Bio-Rad公司);Mastercycler Gradient 5331 PCR仪(德国Eppendorf公司);Typhoon9200荧光成像系统(英国Amersham Biosciences公司);高压垂直电泳系统(美国Bio-Rad公司);GeneSnap凝胶成像系统(英国SynGene公司)。

    1.1.3  生物信息学工具  数据库;GeneBank数据库;IMAGETOOL软件;Imagequant软件(Amersham Biosciences,v2003.02);GeneTools软件(SynGene,Version 3.00.22);SAS软件等。

    1.2  方法

    1.2.1  表达谱构建  Trizol试剂提取ACC-2、ACC-M的总RNA;根据两样品浓度不同取相应体积的总RNA(相当于1 μg),以随机锚定引物5’T25V合成cDNA;利用TaqI限制性内切酶位点一般位于编码区外的特性,将两样品cDNA用TaqI限制性内切酶进行消化,与两种特殊设计的接头混合相连;以64种差异显示引物分别对2种细胞株的转录组片段进行扩增;引物的特殊设计可以使扩增产物覆盖所有转录组片段,引物以Cy5荧光标记;采用6%尿素变性聚丙烯酰胺电泳分离、显示各转录组片段,在荧光成像系统上扫描凝胶,获得表达谱电泳图像［1］。

    1.2.2  表达谱生物信息学分析  图像分析软件测量出所有片段在凝胶上的迁移距离。SAS统计软件进行曲线拟合,找出最佳拟合曲线,各片段bp值。以片断大小和所在“表达窗”作参数,按2%容许误差从数据库（Qbio-gene Inc.& MPBiomedicals Inc公司提供）确定其所对应的基因,每个片段数据均与NCBI GeneBank直接链接。

    1.2.3  Notch基因表达  确定筛选出的Notch各基因在表达谱的位置及大小(bp),比较其在2个基因表达谱间的表达差异。

    1.2.4  半定量RT-PCR验证Notch基因的差异表达  Trizol试剂提取涎腺腺样囊性癌细胞株ACC-2、ACC-M的总RNA;紫外可见分光光度计测定样品D(260 nm)及D(280 nm),根据D(260 nm)将两样品总RNA稀释至相同浓度;各取总RNA用逆转录酶2 μg逆转录为cDNA;等量取cDNA用相对应的引物对Notch的基因片段进行扩增。引物序列及扩增条件见表1。

    PCR循环程序:预变性94 ℃,2 min;变性94 ℃,30 s,退火温度见表1,时间30 s,延伸72 ℃,30 s,循环次数见表1;72 ℃,10 min结束反应。1.5％琼脂糖凝胶电泳分离片段。电泳后凝胶条带经GeneSnap成像后用GeneTools进行半定量分析,结果用各个基因扩增条带的灰度值与内参照β-actin的灰度值的比值表示。所有RT-PCR均行3次试验,两个细胞株Notch基因RT-PCR与内参相对信号强度的比值用均数方差分析。

    2.1  表达谱  电泳结果:条带大小集中在50～1 000 bp,条带间界线清晰,分离效果好,两细胞株共获得有意义条带5 420条,达到表达谱要求。3个Notch基因中Notch2、Notch4在ACC-M表达高于ACC-2,Notch3在两细胞株间的表达接近(表2)。 表1  4个Notch基因RT-PCR的条件表2  Notch基因的RFDD-PCR结果

    2.2  Notch基因RT-PCR  半定量RT-PCR结果显示Notch1、Notch2、Notch4在ACC-M中的表达高于ACC-2(图1)。

    2.3  细胞株Notch基因RT-PCR与内参相对信号强度比较  经过统计学分析(n＝3),Notch1、Notch2、Notch4在ACC-M中的表达明显高于ACC-2(P<0.01);Notch3在两细胞株之间的表达差别无统计学意义(P>0.05,图2)。

    3  讨  论

    Notch基因于1919年在果蝇体内发现,该基因的部分功能缺失会在果蝇翅膀的边缘造成缺口(notch),Notch基因由此而得名。1991年,Notch-1在人类的T淋巴母细胞白血病中首先被鉴定出来,表明了Notch信号通路和肿瘤相关［2］。在乳房肿瘤中,Notch基因、Wnt、成纤维细胞生长因子已被认图1  Notch基因及β-actin的RT-PCR结果

    Fig 1  Expression of Notch genes using RT-PCR

    图2  半定量RT-PCR结果阳性的Notch基因与内参的相对信号强度的比较

    Fig 2  Expression intensity of Notch genes compared with positive control-β-actin

    为是主要的原始致癌基因,人类的很多肿瘤(如头颈部肿瘤、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤等)以及血液系统肿瘤(如霍奇金淋巴瘤、B淋巴细胞白血病等)均发现Notch-1受体的异常表达［3］。Santagata等认为Notch的配体JAGGED1与前列腺癌的进展和转移有关［4］。李大卫等使用组织芯片发现，Notch-1在胃癌中的表达与肿瘤的分化程度及浸润深度、脉管浸润明显相关,这可能是因为Notch-1促进NF-κB表达,而后者上调了基质金属蛋白酶MMP-9及血管内皮生长因子VEGF导致的侵袭浸润增强有关［5-6］。Snijders等报道Notch基因的过表达与口腔鳞状细胞癌相关［7］。Leethanakul等认为Notch可以作为头颈部鳞状细胞癌癌前病变诊断的候选基因和新的靶基因［8］。

    涎腺腺样囊性癌高转移细胞株ACC-M是ACC-2经体外和裸鼠体内连续传代培养分离出的高转移细胞株,其中ACC-M转移率为96%,ACC-2转移率为18%［9］。本研究采用第二代差异显示技术RFDD-PCR构建具有相同遗传背景的涎腺腺样囊性癌高转移细胞株（ACC-M）和低转移细胞株（ACC-2）基因表达谱,通过对表达谱的基因进行生物信息学分析,筛选出大量有差异的候选基因,其中包含Notch基因的表达差异。用半定量RT-PCR方法对涎腺腺样囊性癌高低转移细胞株ACC-M、ACC-2的Notch基因进一步研究,发现两种实验方法的结果基本相同(Notch2、Notch3、Notch4),但也存在一些差异,如RFDD-PCR未发现Notch1基因,而RT-PCR发现它们之间存在差异。同时两种方法的结果也提示,ACC-M细胞株的高转移能力可能与Notch基因的表达有关,有必要进一步研究。

【】
  ［1］ 卢友光,周鸿鹰,丁林灿,等. 涎腺腺样囊性癌高、低转移细胞系基因表达谱及基质金属蛋白酶表达差异［J］. 中华医学遗传学杂志, 2006,23(5):505-510.

［2］ Ellisen L W,Bird J,West D C,et al．TAN-l,the human homolog of the drosophila notch gene,is broken by chromosomal translocations in T lymphoblastic neoplasms［J］．Cell, 1991,66(4):649-661.

［3］ Nickolof B J,Osborne B A,Miele L．Notch signaling as a therapeutic target in cancer:a new approach to the development of cell fate modifying agents［J］. Oncogene, 2003,22(42):6598-6608.

［4］ Santagata S,Demichelis F,Riva A,et al. JAGGED1 expression is associated with prostate cancer metastasis and recurrence［J］. Cancer Res, 2004,64(19):6854-6857.

［5］ 李大卫,吴 晴,彭志海,等. 组织芯片研究Notch1与NF-κB在胃癌中的表达和意义［J］. 肿瘤, 2007,27(6):458-461.

［6］ Wang Z,Banerjee S,Li Y,et al．Down-regulation of notch-1 inhibits invasion by inactivation of nuclear factor-kappaB,vascular endothelial growth factor,and matrix metalloproteinase-9 in pancreatic cancer cells［J］. Cancer Res, 2006,66(5):2778-2784.

［7］ Snijders A M,Schmidt B L,Fridlyand J,et al. Rare amplicons implicate frequent deregulation of cell fate specification pathways in oral squamous cell carcinoma［J］. Oncogene, 2005,24(26):4232-4242.

［8］ Leethanakul C,Patel V,Gillespie J,et al. Distinct pattern of expression of differentiation and growth-related genes in squamous cell carcinomas of the head and neck revealed by the use of laser capture microdissection and cDNA arrays［J］. Oncogene, 2000,19(28):3220-3224.

［9］ 关晓峰,邱蔚六,何荣根,等. 肺高转移性涎腺腺样囊性癌细胞株的筛选［J］. 中华口腔医学杂志, 1996,31(2):74-77