三七总甙对氧化低密度脂蛋白诱导系膜细胞TGF-β1与单核细胞趋化蛋白-1表达的影响
【摘要】 目的 探讨三七总甙(PNS)对氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)诱导大鼠肾小球系膜细胞表达转化生长因子-β1(TGF-β1)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)及核转录因子-κB(NF-κB)活性的影响。 方法 体外培养大鼠肾小球系膜细胞,随机分为对照组、诱导组(OX-LDL 50 μg/mL)和PNS 200,400,800 μg/mL组。半定量RT-PCR检测TGF-β1与MCP-1的mRNA表达,ELISA检测TGF-β1与MCP-1蛋白含量,免疫细胞化学观察NF-κB p65核转位。 结果 OX-LDL诱导系膜细胞TGF-β1与MCP-1表达增强,NF-κB活化,p65核转位率增加。PNS干预后,TGF-β1与MCP-1表达及NF-κB p65核转位率较诱导组明显下降。 结论 PNS抑制OX-LDL诱导的系膜细胞TGF-β1与MCP-1表达;其机制可能与影响NF-κB核转位有关。
【关键词】 三七皂甙; 脂蛋白类,LDL; 肾小球膜; 细胞,培养的; NF-κB; 转化核因子β; 单核细胞化学吸引蛋白质1
ABSTRACT: Objective To explore the effect of panax notoginseng（PNS） on expressions of transforming growth factor beta(TGF-β1) and MCP-1 and the activity of NF-κB in rat mesangial cells induced by OX-LDL. Methods A rat glomerular mesangial cell(MC) line cultured in vitro was stimulated by OX-LDL(50 μg/mL) and then treated with PNS(200～800 μg/mL). RT-PCR was used to detect the expressions of TGF-β1 and MCP-1 mRNA. ELISA was used to determine the levels of TGF-β1 and MCP-1 protein in the supernatant. And the translocation of NF-κB p65 was observed by immunocytochemistry. Results OX-LDL significantly increased the expressions of TGF-β1 and MCP-1 in MC. After adding PNS, the expression levels of TGF-β1 and MCP-1 remarkably decreased compared with those in cells stimulated by OX-LDL. NF-κB activity markedly increased after stimulation by OX-LDL, the translocation rate of p65 from cytoplasm to nucleus was higher than that in the control group. This effect could be inhibited by PNS. Conclusion OX-LDL could promote expressions of TGF-β1 and MCP-1 in MC. PNS could inhibit this promotion of OX-LDL. The effects of PNS on the activation of NF-κB and translocation of p65 may be one of the mechanisms.
KEY WORDS: sanchinoside; lipoprotein,LDL; glomerular mesangium; cells,cultured; NF-kappa B; transforming growth factor beta; monocyte chemoattractant prolein-1
氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)与肾脏疾病的进展有着密切联系［1］。肾小球系膜细胞在OX-LDL刺激下能够异常表达多种细胞因子,包括在组织中具有极强致纤维化效应的转化生长因子-β1(TGF-β1),以及介导单核-巨噬细胞向肾小球系膜区浸润的关键因子——单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1);这些细胞因子的异常表达与核转录因子-κB(NF-κB)有关［2-3］。笔者观察系膜细胞在OX-LDL与三七总甙(panax notoginseng saponins,PNS)作用后TGF-β1与MCP-1表达变化及NF-κB核转位情况,对PNS在脂质性肾损伤中可能的保护效应进行探讨。
1 材料与方法
1.1 材料 大鼠肾小球系膜细胞（武汉典型培养物保藏中心），以含10%胎牛血清的MEM进行常规贴壁培养，OX-LDL（中国协和医科大学生化教研室），三七总甙(纯度>99%,云南金泰得公司)，Trizol(美国Invitrogen公司)，逆转录试剂盒(立陶宛Fermentas公司)；TGF-β1 ELISA试剂盒（武汉博士德公司）,MCP-1 ELISA试剂盒（上海森雄科技公司），ImageMaster VDS凝胶成像分析系统(英国Syngene Genius)，兔抗大鼠NF-κB p65多克隆抗体（美国Santa Cruz公司)。
1.2 方法
1.2.1 分组 系膜细胞随机分为5组,每组5个复孔:(1)对照组:MEM;(2)诱导组:MEM+OX-LDL 50 μg/mL;(3)PNS 200 μg/mL组:MEM+OX-LDL 50 μg/mL+PNS 200 μg/mL;(4)PNS 400 μg/mL组:MEM+OX-LDL 50 μg/mL+PNS 400 μg/mL;(5)PNS 800 μg/mL组:MEM+OX-LDL 50 μg/mL+PNS 800 μg/mL。培养24,36,48 h后收集各组细胞检测TGF-β1与MCP-1的mRNA表达,培养48 h后收集上清存-70 ℃备用。
1.2.2 RT-PCR检测TGF-β1与MCP-1的mRNA表达 提取总RNA,按说明书进行cDNA合成,产物-20 ℃保存。PCR引物由上海鼎安生物科技公司合成。
TGF-β1(392 bp)
上游:5’-GGACTCTCCACCTGCAAGAC-3′
下游:5’-CTCTGCAGGCGCAGCTCTG-3′
MCP-1(421 bp)
上游:5’-CAGATCTCTCTTCCTCCACCA-3’
下游:5’-GTGGAAAAGAGAGTGGATGCA-3’
β-actin(607 bp)
上游:5’-ATGCCATCCTGCGTCTGGACCTGGC-3’
下游:5’-AGCATTTGCGGTGCACGATGGAGGG-3’
PCR反应条件:95 ℃ 5 min→95 ℃ 45 s→退火1 min(TGF-β1 55 ℃,MCP-1 56 ℃)→72 ℃ 1 min,30个循环,最后72 ℃延伸10 min。产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳,应用凝胶成像分析系统作灰度扫描,以β-actin为内参照,以目的基因条带和β-actin条带的灰度值之比表示目的基因的表达强度。
1.2.3 ELISA检测TGF-β1与MCP-1蛋白含量 操作按试剂盒说明书进行，以光密度D值表示上清中待测蛋白含量。
1.2.4 免疫细胞化学观察NF-κB p65核转位 系膜细胞培养于预先放置盖玻片的培养板。随机分为3组:(1)对照组:MEM;(2)诱导组:MEM+OX-LDL 50 μg/mL;(3)PNS组:MEM+OX-LDL 50 μg/mL+PNS 800 μg/mL。继续培养1,4,6 h后收集细胞铺片。4%多聚甲醛室温固定10 min;1%Triton-100室温作用10 min;3%H2O2室温作用8 min;山羊血清封闭;一抗37 ℃孵育90 min;二抗室温孵育30 min;DAB显色;苏木精对比染色;0.1%盐酸乙醇分化;脱水;晾干;中性树胶封固。实验中以PBS代替一抗,作为阴性对照。显微镜下观察细胞,以细胞核内有NF-κB p65的阳性染色表示NF-κB的活化,即p65核转位阳性。随机选取5个视野核转位阳性细胞比例。
1.3 统计学处理 数据以x±s表示,经SPSS 12.0统计软件分析。多组间比较及组间两两比较,计量资料用单因素方差分析和q检验。计数资料用χ2检验。
2 结 果
2.1 PNS对OX-LDL诱导系膜细胞TGF-β1表达的影响 与对照组比较,诱导组TGF-β1的mRNA表达与蛋白水平均明显升高。与诱导组比较,800 μg/mL PNS组在各时间点上mRNA表达以及400 μg/mL PNS组在36,48 h上mRNA表达均明显降低;干预48 h后,800 μg/mL PNS组与400 μg/mL PNS组的TGF-β1蛋白含量亦较诱导组下降(P<0.01),并且800 μg/mL PNS组的TGF-β1表达低于400 μg/mL PNS组(P<0.05)。但200 μg/mL PNS组与诱导组在各时间点上差别无统计学意义(P>0.05,表1,2,图1)。
2.2 PNS对OX-LDL诱导系膜细胞MCP-1表达的影响 与对照组比较,诱导组MCP-1 mRNA表达与蛋白含量均明显升高。与诱导组的mRNA表达比较,800 μg/mL PNS组在各时间点上、400 μg/mL PNS组在36,48 h以及200 μg/mL PNS组在48 h表达均明显降低。干预48 h后,各PNS组MCP-1蛋白含量均较诱导组下降(P<0.05)。不同浓度PNS组比较,随着PNS浓度增高,MCP-1表达逐渐下降,差别有统计学意义(P<0.01,表2,3,图2)。
2.3 PNS对OX-LDL诱导系膜细胞NF-κB活化表1 PNS对OX-LDL诱导系膜细胞TGF-β1 mRNA表达的影响表2 PNS对OX-LDL诱导系膜细胞TGF-β1与MCP-1蛋白表达的影响的影响 对照组系膜细胞大多于细胞质着色,细胞核内NF-κB p65呈空染,仅少量细胞p65核染色阳性(图3)。加入OX-LDL刺激后,NF-κB p65核染色阳性细胞较对照组明显增多。PNS组与诱导组比较,在4,6 h上p65核染色阳性细胞明显减少(P<0.01,表4,图4)。表3 PNS对OX-LDL诱导系膜细胞MCP-1 mRNA表达的影响表4 PNS对OX-LDL诱导系膜细胞NF-κB活化的影响
3 讨 论
关于脂质性肾脏疾病的研究表明,各类脂蛋白沉积于肾小球后,可以在系膜细胞、局部浸润的巨噬细胞及其释放的氧自由基作用下,发生过氧化修饰,产生OX-LDL;OX-LDL持续作用于肾脏固有细胞,介导肾小球的免疫炎症损伤,促进肾组织纤维化的进展［1］。TGF-β1是肾小球硬化和肾间质纤维化进程中关键的细胞因子。病理条件下的肾脏组织产生过多TGF-β1,并以自分泌和旁分泌的方式作用于肾小球系膜细胞、足细胞、肾小管上皮细胞,促进胶原合成与细胞外基质沉积,影响细胞凋亡,刺激肾小管上皮细胞-肌纤维母细胞转分化,在多个途径及环节上发挥促纤维化效应［4］。MCP-1则是介导单核-巨噬细胞和T淋巴细胞趋化、激活过程的主要因子,属趋化因子家族中C-C亚家族成员。在多种肾小球疾病及实验性肾炎的动物模型中均发现MCP-1的表达上调。MCP-1表达上调可促进单核细胞向肾小球系膜区浸润及其在肾小球的增生、聚集,并进一步活化释放活性氧、活性氮及溶酶体酶等多种炎症介质,造成组织损伤［5］。有报道,在TGF-β1与MCP-1的启动子上游序列中均存在NF-κB的特异性结合位点,提示NF-κB参与了TGF-β1与MCP-1的基因表达调控［2-3］。
NF-κB是一个与细胞内免疫炎症因子的基因表达密切相关的转录调节因子。细胞静息状态下,NF-κB以无活性的p65-p50-ⅠκB三聚体形式存在于细胞质中,在外界信号刺激下,抑制因子IκB发生降解并与NF-κB解离,NF-κB被激活,进入细胞核与靶基因的启动子序列上的κB位点相结合,启动基因转录和蛋白合成［6］。在NF-κB的活化过程中,活性氧中间代谢产物起着重要作用,因为研究证实许多抗氧化剂能有效抑制NF-κB的活化［7］。
PNS是中药三七的主要有效成分,研究提示PNS具有抗肾间质纤维化的活性,其药理作用包括抑制肾小管上皮细胞的增殖及胶原分泌,促进肾成纤维细胞凋亡等［8-9］。此外,PNS可能通过保护抗氧化酶,清除氧自由基而拮抗组织的过氧化反应［10］。本研究表明,OX-LDL 50μg/mL作用于系膜细胞24,36,48 h后均可引起TGF-β1与MCP-1表达增强;而PNS在特定的浓度范围和作用时间内能明显抑制OX-LDL诱导的TGF-β1与MCP-1表达。从浓度看,在干预系膜细胞48 h后,200 μg/mL PNS不影响OX-LDL诱导的系膜细胞TGF-β1表达,而400 μg/mL与800 μg/mL PNS可明显抑制OX-LDL诱导的系膜细胞TGF-β1表达,且PNS 800 μg/mL的抑制效应要强于400 μg/mL。而对OX-LDL诱导的MCP-1表达,PNS从200～800 μg/mL均可使MCP-1表达回降。随着PNS浓度升高,MCP-1表达下降更为明显,在各时间点上PNS均以800 μg/mL作用最强。从时间看,PNS作用时间延长,TGF-β1与MCP-1表达逐渐下降。PNS作用48 h后抑制效应最明显。因此本研究在48 h用ELISA检测上清中TGF-β1与MCP-1的蛋白含量,结果与RT-PCR大致相符,说明PNS可有效抑制OX-LDL诱导的系膜细胞TGF-β1与MCP-1表达。此外,在OX-LDL和PNS作用下,系膜细胞TGF-β1和MCP-1表达水平的变化基本趋向一致。一方面两者的基因表达调控存在不同的信号转导通路［2,11］;另一方面,也有研究发现TGF-β1可以通过依赖于结缔组织生长因子及磷酸二酯酶的途径促进MCP-1基因表达［12］。因此,OX-LDL和PNS可能通过对TGF-β1表达的影响从而相应地调节了MCP-1的表达。
本研究同时观察OX-LDL和PNS对系膜细胞NF-κB活化的影响,OX-LDL 50 μg/mL作用于系膜细胞可引起NF-κB的活化,发生p65核转位;而PNS 800 μg/mL作用4,6 h后,能够抑制OX-LDL诱导的NF-κB活化,p65核转位阳性率较诱导组明显下降,推测PNS抑制TGF-β1和MCP-1表达的作用至少有一部分原因与其抑制了p65的核转位有关。笔者认为,PNS可能通过影响OX-LDL诱导的系膜细胞NF-κB活化,抑制细胞因子的异常表达,从而减轻肾小球的炎症反应和纤维化病变。这可能是三七对OX-LDL导致的脂质性肾损伤具有保护效应的作用机理之一。但本研究存在的问题是,PNS对NF-κB的影响具体作用于哪一部分的亚基,以及在相关信号通路上特异的作用靶点,均有待进一步探讨。
【】
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