建立卵巢过度刺激综合征大鼠模型的研究

【摘要】  目的 构建卵巢过度刺激综合征(OHSS)的大鼠模型。方法 32只未成年Wistar雌鼠，随机分为常规刺激组和过度刺激组。过度刺激组：22日龄Wistar雌鼠连续4天皮下注射含有10 IU PMSG的生理盐水0.2ml，至26日龄皮下注射含有30 IU hCG的生理盐水0.2ml。设立对照组为常规刺激组：24日龄Wistar雌鼠皮下注射含有10IU PMSG的生理盐水0.2ml，再予皮下注射含有10IU hCG的生理盐水0.2ml。测血E2水平，尾静脉注入美兰溶液30min后取腹腔灌洗液和卵巢，用分光光度计分别测定腹腔灌洗液和卵巢组织中的美兰含量来判断腹膜和卵巢血管通透性；比较两组间卵巢重量，血E2水平及卵巢、腹腔液中美兰含量。结果 注射hCG 48h后，过度刺激组大鼠卵巢重量、血E2水平、腹腔液和卵巢中美兰含量均显著高于常规刺激组。结论 利用适当日龄Wister大鼠可以成功构建OHSS动物模型。

【关键词】  卵巢过度刺激综合征；动物模型；大鼠

    ABSTRACT：Objective To establish the rat model of ovarian hyperstimulation syndrome(OHSS).Methods Immature female Wistar rats aged 22 days were divided into two groups: the OHSS group (16 rats) was given 10 IU PMSG for 4 consecutive days and given 30 IU hCG on 26?day?old to produce ovarian hyperstimulated manifestations; the conventional stimulation group (16 rats) was given 10 IU PMSG on 24?day?old and given 10 IU hCG on 26?day?old. On 28?day?old, the rats were injected via the tail vein Methylene blue dye solution to evaluate the capillary permeability in the peritoneal cavity and ovary; blood samples were collected from the inferior caval vein to evaluate serum estradiol(E2). Results Compared with the conventional group,the contents of methylene blue in peritoneal cavity and ovarian were significantly higher in the OHSS group; Ovarian wet weights and serum concentration of E2 were also markedly increased. Conclusion The animal model of OHSS can be induced by injected PMSG and hCG on immature female Wistar rats.

    KEY WORDS：Ovarian hyperstimulation syndrome(OHSS); Animal model; Rat

    卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome ,OHSS)是辅助生育技术中超促排卵时发生的一种医源性并发症，OHSS主要病理表现为卵巢增大，多发性滤泡囊肿及黄体囊肿形成；病理生理机制主要为全身毛细血管通透性增加；临床表现为胃肠道不适、腹水、胸水、少尿、卵巢增大等，严重可危及生命。为了方便更深入地对OHSS发病的具体机制及药物效果进行研究，人们建立了多种OHSS的动物模型。本文主要研究国产孕马血清促性腺激素（pregrant mate's serum gonadotropin,PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)在未成年Wistar大鼠建立OHSS模型的可行性。

    1  材料与方法

    1．1  动物及分组

    清洁级雌性Wistar大鼠32只，22日龄，体重49～58g,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。黑暗12h，光照12h。大鼠随机分为两组：过度刺激组，常规刺激组，每组16只。每组8只用于腹膜、卵巢血管通透性和卵巢重量测定；另8只用于测血雌二醇（estradiol,E2)水平。

    1．2  实验方法

    1．2．1  用药方案

    过度刺激组: 22日龄Wistar雌鼠连续4天皮下注射含有10IU PMSG（天津实验动物中心)的生理盐水0.2ml，再皮下注射含有30IU hCG(丽珠药业）的生理盐水0.2ml。常规刺激组：24日龄Wistar雌鼠皮下注射含有10IU PMSG的生理盐水0.2ml，至26日龄皮下注射含有10IU HCG的生理盐水0.2ml。

    1．2．2  腹膜、卵巢血管通透性和卵巢重量的测定

    注射hCG后48h，每组8只Wistar大鼠在苯巴比妥钠（80mg/Kg）麻醉下，从尾静脉注入0.2 ml美兰溶液(5mmol/L),30min后用5ml生理盐水灌洗腹腔，收集灌洗液入试管,立刻加入50μl  0.1mol/L的NaOH，以清除蛋白质造成的混浊。在腹腔灌洗后立即取出卵巢称重，并两侧卵巢总重量。将卵巢加入4ml二甲基甲酰胺中，65℃水浴中孵育24h。腹腔灌洗液和卵巢孵育液在室温下900×g离心10min，取上清，应用分光光度计在美兰最大吸收光谱660nm处检测吸光度，从标准曲线上查得美兰含量。腹腔液中美兰含量以μg/100g体重表示，卵巢中美兰含量以ng/mg卵巢组织表示。

    1．2. 3  血清E2水平测定

    每组另外8只Wistar大鼠在苯巴比妥钠（80mg/Kg）麻醉下剖腹抽取下腔静脉血3ml，室温放置1h，3000×g离心10min，吸取血清贮存于－20℃待测。采用放射免疫法（RIA）测定血清E2水平，放免试剂盒购自天津DPC公司,严格按说明书的方法操作。

    1．3  统计分析

    采用SPSS11.0软件进行t检验分析，计量数据以（±s）表示。P <0.05有统计学意义。

    2．1  病理观察

    注射hCG后48h，过度刺激组Wistar大鼠卵巢重量显著增加，体积显著增大，表面呈紫褐色，见多个囊肿突出。

    2．2  两组间各项研究指标的比较

    注射hCG后48h，常规刺激组Wistar大鼠卵巢总重量为（108.98±4.21)mg，过度刺激组卵巢总重量为（319.39±6.35)mg；常规刺激组Wistar大鼠腹腔液美蓝含量（1.06±0.03)μg/100g，过度刺激组腹腔液美蓝含量（4.18±0.13)μg/100g；常规刺激组Wistar大鼠卵巢美蓝含量（10.30±1.30)ng/mg，过度刺激组卵巢美蓝含量（34.63±1.85)ng/mg；常规刺激组Wistar大鼠血清E2水平为（21.85±1.73)pg/ml，过度刺激组血清E2水平为（56.07±6.45)pg/ml。两组间以上各项指标比较，其变化量均有显著性差异（P < 0.05）。

    3  讨  论

    目前普遍认为OHSS发生与过多卵泡被刺激起来并应用HCG诱发排卵有关。特别是控制性超排卵过程中，由于临床促性腺激素 (gonadotropin, Gn)的过量使用或病人对Gn反应性过于敏感，出现大批卵泡生长，卵巢多发性黄体囊肿及滤泡囊肿形成，在这个过程中卵巢大量分泌和产生卵泡发育和黄体形成所必需的调节新生血管的血管活性物质，这些血管活性物质不仅作用于卵巢，还作用于全身，导致全身毛细血管通透性增加，从而出现OHSS临床症状。关于OHSS发病机理和机制的研究一直是生殖医学研究的热点之一。本研究用国产PMSG代替eCG(equine chorionic gonadotrophin)，依照Ujioka等[1]的方法在未成年Wistar大鼠体内建立OHSS模型，结果显示大鼠卵巢重量显著增加、体积显著增大、表面呈紫褐色，见多个囊肿形成，血E2水平明显升高；大鼠尾静脉注射美兰30min后，腹腔灌洗液和卵巢组织中美兰含量均显著增高，提示卵巢和腹膜毛细血管通透性均增加，与常规刺激组相比，差异有显著性意义（P＜0.05)。根据Golan[2]的标准：卵巢体积增大、腹腔毛细血管通透性增加和腹水均出现方可诊断为卵巢过度刺激综合征，可诊断为卵巢过度刺激综合征。本研究证实在Wistar大鼠建立OHSS模型是可行的，可以满足对OHSS的实验研究要求。根据大鼠正常动情周期，大鼠黄体形成及退化（动情后期及动情间期）持续约70－84h，hCG注射后48h相当于黄体早期，适用于外源性hCG诱发的早发型OHSS的研究。

    目前国外OHSS造模对象包括兔、恒河猴、成年大鼠等[3～5] ，但存在造模周期长，价格昂贵，操作复杂等问题，本实验用国产PMSG在未成年Wistar大鼠中建立OHSS模型，所用Gn剂量较小，价格便宜，持续注射时间较短，还可以避免上一动情周期的生殖激素水平影响。同时本实验用常规刺激组作为对照，保证两组间卵泡期和黄体期保持一致，从而克服空白对照时过度刺激组处于性未成熟期，而过度刺激组已处于OHSS发病的黄体期的缺点，增加两组间各项研究指标的可比性。

    本研究通过利用国产PMSG和HCG成功在未成年Wistar大鼠建立OHSS模型，为进一步系统探讨OHSS确切发病机理及相关药物治疗的研究奠定了基础。

【】
  [1]Ujioka T, Matsuura K, Kawanno T, et al. Role of progesterone in capillary permeability in hyperstimulated rats[J]. Hum Reprod,1997, 12: 1629

[2] Golan A, Ronel R, Soffer Y, et al. Ovarian hyperstimulation syndrome: an update review[J]. Obstet Gynecol Survey,1989, 44: 430

[3] Polishuk WZ, Schenker JG. Ovarian overstimulation syndrome[J]. Fertile Steril,1969,20:443

[4] Molskness TA, Stouffer RL, Burry KA, et al. Circulating levels of free and total vascular endothelial growth factor (VEGF)?A, soluble VEGF receptors?1 and ?2, and angiogenin during ovarian stimulation in non?human primates and women[J]. Hum Reprod, 2004,19(4):822

[5] Ajonuma LC,Tsang LL, Zhang GH, et al. Estrogen?induced abnormally high CFTR expression results in ovarian hyperstimulation syndrome[J].Mol Endocrinol, 2005, 19(12):3038