银杏叶提取物对大鼠实验性结肠炎COX?2表达的影响

【摘要】  目的观察银杏叶提取物对结肠炎大鼠结肠组织环氧合酶?2 (cyclooxygenase?2, COX?2)表达的影响。方法 应用三硝基苯磺酸(TNBS)灌肠制备大鼠实验性结肠炎模型。实验设正常对照组，三硝基苯磺酸模型组，阳性药物对照组(5?ASA group ,100 mg/kg)，银杏叶提取物（EGB）组(200 mg/kg)4组。评估大鼠结肠黏膜大体形态和组织学评分。免疫组化检测肠组织环氧合酶?2（COX?2）蛋白的表达。结果 与模型组相比，EGB组结肠组织COX?2表达明显减少，EGB能明显减轻大鼠实验性结肠炎模型组大体形态和组织学评分。结论 EGB可能通过抑制炎性细胞因子（TNF?α, NF?κBp65, IL?6）的表达，从而抑制COX?2生成，对大鼠实验性结肠炎具有保护作用。

【关键词】  银杏叶提取物；溃疡性结肠炎; 环氧合酶?2

    ABSTRACT:Objective To study the influence of Ginkgo biloba extract(EGB) on the expression of cyclooxygenase?2(COX?2) in experimental colitis in rats. Methods Colitis in rats was induced by colonic administration with 2,4,6?trinitrobenzene sulfonic acid .The animals were divided into 4 groups: normal group, model group,5?ASA (5?aminosalicylic acid,100 mg/kg) group ,EGB (200 mg/kg) group. The macroscopical and histological changes of the colon were evaluated. Expression of COX?2 in the colon tissues was detected by immunohistochemistry.Results The expression of COX?2 of colon tissue in EGB group were obviously lower than those of model group. As compared with the model group, EGB notably reduced colon macroscopic and histological scores. Conclusion EGB could alleviate the inflammatory reactions in colitis through inhibiting Inflammatory mediators (TNF-α, NF?κBp65, IL?6) and decreasing the generation of COX?2.

    KEY WORDS:Ginkgo biloba extract; Ulcerative colitis; Cyclooxygenase?2

    银杏叶提取物广泛用于呼吸系统、心脑血管系统等疾病，有清除自由基和过氧化脂质、调节循环系统、改善血液循环、拮抗血小板活化因子、保护组织等作用。环氧合酶?2 (cyclooxygenase?2, COX?2)诱导产生PGs(主要是PGE2)是溃疡性结肠炎（UC）炎症反应过程中的关键环节，阻断COX?2的表达从而减少PGs生成可以控制UC炎症反应过程[1]。银杏叶提取物对溃疡性结肠炎COX?2表达的影响，尚未见研究报道。我们在前期研究[2]的基础上，进一步观察EGB对大鼠实验性结肠炎COX?2表达的影响，探讨EGB防治UC的可能机制。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    雄性Wistar大鼠40只，体质量为180±20g，购自湖北省实验动物中心；2，4，6?三硝基苯磺酸（2,4,6?trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）购自Sigma公司；银杏叶提取物为贵州信邦制药股份有限公司提供；环氧合酶?2（COX?2）多克隆抗体购自Santa Cruz公司；SP试剂盒为北京中山生物制品公司产品。

    1.2  方法

    动物随机分为正常对照组（normal group），三硝基苯磺酸模型组（model group），阳性药物对照组（5?aminosalicylic acid，5?ASA group），EGB组（EGB group）4组，每组10只。造模前大鼠禁食不禁水24 h。正常对照组以500 mL/L乙醇灌肠，其他组均以TNBS灌肠诱导实验性结肠炎形成。按[3]方法造模， TNBS（150 mg/kg）溶解于500 ml/L乙醇溶液缓慢推入结肠。造模24 h后4组分别予以生理盐水2 ml，5?ASA100 mg/kg，EGB 200 mg/kg 灌胃治疗，每天1次连续4 周。4 周后处死大鼠，分离结肠，沿肠系膜纵轴剪开，冷生理盐水冲洗干净，参照文献[3]标准进行肉眼大体形态损伤评分和镜下评价结肠组织学损伤评分。

    1.3  免疫组化检测肠组织COX?2表达

    操作按照SP 免疫组化染色试剂盒说明书进行。PBS代替一抗作阴性对照。结果判断: 细胞呈棕黄色为阳性，表达于胞浆。每张切片任意10个高倍视野（200倍）中阳性细胞所占的百分比例。

    1.4  统计学处理

    实验数据以±s 表示，采用SPSS11.5软件进行统计学分析，两组间比较用单因素方差分析，组间差异采用q检验。以P<0.05为有统计学意义。

     2.1  结肠大体形态和组织学评分

    大体形态评分：模型组肉眼观察到肠粘膜水肿、溃疡、点片状出血。EGB组及 5?ASA组肠黏膜充血、水肿、糜烂情况显著改善（P<0.01），见表1。组织学损伤评分：三硝基苯磺酸模型组黏膜上皮坏死脱落，典型溃疡形成。EGB组和5?ASA组以上病理组织表现明显好转（P<0.01），见表1。EGB组较5?ASA组好转更加明显( P<0.05)，见表1。表1  各组大鼠大体形态、组织学评分和COX?2表达的比较(略)与模型组比较，** P<0 .01；与5?ASA组比较， △P<0 .05

    2.2  免疫组化染色结果

    正常对照组COX?2几乎不表达。模型组肠组织可见大量COX?2阳性细胞，呈棕黄色颗粒，胞质着色，主要分布在黏膜及黏膜下层，较正常对照组表达明显升高（P<0.01）。EGB和5?ASA 后较模型组COX?2表达明显下降（P<0.01），EGB组较5?ASA组下降更加明显（P<0.05）。见表1。

    3  讨  论

    COX?2是炎症反应中催化前列腺素合成的一个关键诱导酶，在生理情况下很少表达，在病理情况下被诱导表达并参与炎症反应。许多刺激物如生长因子、炎性细胞因子（TNF?α, NF?κBp65, IL?6）、花生四烯酸、肿瘤诱导剂等可刺激细胞的COX?2表达，而抗炎细胞因子及糖皮质激素则可抑制COX?2产生。越来越多的证据表明COX?2及其诱导产生的PGs在炎症修复过程中发挥重要作用。花生四烯酸代谢异常是IBD致病的重要环节，作为花生四烯酸代谢生成重要炎症介质PGE2的主要限速酶COX?2在IBD肠组织中迅速大量增加，合成大量病理性PGE2。大量研究证实抑制花生四烯酸代谢过度可明显减轻IBD炎症损害。研究表明正常结肠黏膜绝大多数情况下不表达COX?2，炎症粘膜上皮细胞及结肠固有层单核炎性细胞表COX?2;在炎症活动期结肠固有层和肌间神经丛中COX?2 mRNA表达水平明显高于非活动期[4]。COX?2的表达可以激活NF?kB，并形成正反馈自我调节环路，导致炎症级联和组织损害，导致溃疡性结肠炎的发生和。

    本研究中实验性结肠炎大鼠模型组结肠组织COX?2表达明显升高，提示花生四烯酸代谢过度，EGB可明显减少其表达，有效缓解炎症反应，改善其病理损害，从而起到一定的治疗作用。银杏叶提取物具有抗氧化、抗炎、调节循环系统、改善血液循环、基因调节等作用。如前所述，COX?2作为炎症相关基因受NF-KB调控，抑制NF-KB可以抑制COX?2启动子的活性。本课题组前期研究表明EGB可能通过其抗氧化作用下调炎症介质（TNF?α, NF?κBp65, IL?6），保护TNBS诱导的溃疡性结肠炎[2]。我们推测EGB可能通过下调促炎细胞因子（TNF?α, NF?κBp65, IL?6）来抑制COX?2的产生，对大鼠实验性结肠炎具有保护作用。

【】
  [1]Fiocchi C. Inflammatory bowel disease : Etiology and pathogenesis[J].Gastroeanterology，1998，115(2): 182

[2] Zhou YH, Yu JP, Liu YF, et al. Effects of Ginkgo biloba extract on inflammatory mediators (SOD, MDA, TNF?alpha, NF?kappaBp65, IL?6) in TNBS?induced colitis in rats[J]. Mediators Inflamm，2006，2006(5): 92642

[3] Morris GP, Beck PL, Herridge MS,et al. Hapten?induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon [J]. Gastroenterology, 1989，96:795

[4] Roberts PJ,Morgan K,Miller R,et al. Neuronal COX?2 expression in human myenteric plexus in active inflammatory bowel disease [J].Gut,2001，48(4):468