白藜芦醇对宫颈癌细胞株Hela增殖的影响
【摘要】 目的 研究白藜芦醇诱导宫颈癌细胞株Hela的细胞生长和发育的改变，细胞周期的进行和凋亡等。方法 MTT法测定白藜芦醇对Hela细胞的作用。3H-TdR掺入法检测白藜芦醇对Hela细胞DNA合成的影响。流式细胞术分析细胞周期。结果 白藜芦醇作用后，Hela细胞的增殖速度减缓，DNA合成减少。白藜芦醇在较低浓度时即可诱导较快的可逆的S期停滞。结论 合适浓度的白藜芦醇可有效预防早期肿瘤，但不至于引起细胞毒作用和细胞死亡。
【关键词】 白藜芦醇；细胞周期；宫颈癌；Hela细胞
ABSTRACT：Objective To study the effects of Resveratrol on the growth, development,cell cycle and apoptosis of cervical cancer cells?Hela cells. Methods Measure the effects of Resveratrol on Hela cells by MTT. Detect the influence of Resveratrol on DNA synthesis of Hela cells through 3H?TdR infiltration methods. Analyze cell cycle by flow cytometry. Rusults After the treatment with Resveratrol ,Hela cells proliferate more slowly.The synthesis of DNA decreases. Resveratrol at low concentration can induce fast and reversible blockage at phase S by flow cytometry assay.Conclusion Suitable concentration of resveratrol could ffectively prevent tumor in early stage without cytotoxic or cytonecrotic side?effect.
KEY WORDS: Resveratrol;Cell cycle；Cervical cancer;Hela cells
白藜芦醇(Resveratrol)又称芪三酚，是一种条件下存在的多酚类化合物，在我们日常的食物中均有存在，如：葡萄、花生和红酒等[1]。有研究显示它有多种生物学效应，包括保护心血管、抗癌、延年益寿等。已有实验室研究发现白藜芦醇能增加酵母、后生动物和其它实验室动物的寿命[2]。但是，目前其发挥作用的相关细胞学和分子生物学机制尚未完全明了。
近来的机研究显示肿瘤的发生是一个长期的过程，它与各种细胞周期中的事件密切相关，包括细胞凋亡的启动和执行等等。采用化学药物来抑制细胞周期的进行或干扰肿瘤细胞的生长，增殖诱导其细胞凋亡等策略渐渐被人们所接受[3]。我们在研究中，检测了白藜芦醇对人宫颈癌细胞株Hela的细胞增殖和生存，细胞周期的进行、凋亡等的影响。
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器
白藜芦醇（化学纯）、MTT、DMSO、SDS，碘化丙啶(PI) 、RNase A均购自上海申氏化工。RPMI 1640液体培养基和小牛血清购自晶美公司。流式细胞仪（COULTER XL; Coulter）；酶标仪（GENIOS，TECAN）；β?液闪仪(MicroBeta Trilux, PerkinElmer Life Sciences)。
1.2 细胞培养
人宫颈癌细胞株Hela购自美国典型菌种收藏所(ATCC, Manassas,VA)，RPMI 1640培养基加10%小牛血清，培养于37℃含5% CO2细胞培养箱。
1.3 细胞活力及成长测定
MTT法测定白藜芦醇对Hela细胞的作用[4]。即：将细胞以密度为1×104/孔接种于96孔板，培养12h后，加入不同浓度的白藜芦醇(12.5～100 μM)继续培养。设立空白对照。细胞培养12h、24h、36h后加入MTT(5 mg/ml)继续培养4h，加100 μl DMSO，平板震荡仪上震荡5 min。酶标仪上波长560nm测定OD值。
1.4 DNA合成测定
Hela细胞1×104/孔接种于96孔板，培养12h后，加入不同浓度的白藜芦醇(12.5～100 μM)继续培养。细胞中加入3H?TdR 0.5～1.0μCi/孔，继续培养6h，然后收获细胞于玻璃纤维滤纸上[5]。烤干后，将滤纸放入闪烁杯中，每杯加闪烁液5ml，β?液闪仪测定各管cpm。
1.5 流式细胞仪分析细胞周期
Hela细胞培养于6孔板一定时间，加入或不加白藜芦醇。培养不同时间后收获细胞用PBS洗，混于冷的70%乙醇中4℃过夜。然后细胞用冷PBS洗，再用PI/RNase A溶液37℃孵育20min，上机分析[6]。
1.6 统计学分析
数据用SPSS 10. 0软件处理，计量资料用均数±标准差(±s)表示，检验用于检测组间差异。P＜0.05为具有统计学意义。
2 结 果
2.1 白藜芦醇对Hela细胞生长的影响
应用不同浓度白藜芦醇处理细胞12h，24h和36h后，细胞生长率呈浓度依赖性降低（图1）。不同浓度的白藜芦醇作用后，细胞生长情况有明显差异(P＜0.05)。其中，白藜芦醇浓度为100 μM时，细胞的增殖几乎停止。低浓度(<25 μM)时细胞增殖在36h后有恢复趋势。
图1 MTT法检测不同浓度白藜芦醇
对Hela细胞生长的影响2.2 白藜芦醇对Hela细胞增殖过程中DNA合成的影响
3H?TdR掺入法检测白藜芦醇对Hela细胞DNA合成的影响。应用不同浓度白藜芦醇处理细胞24h后，结果显示白藜芦醇以浓度依赖的方式抑制细胞DNA的合成。白藜芦醇的浓度为50 μM时，90％以上的DNA合成被抑制；浓度为100 μM时，只有极低的DNA合成 (图2)。
图2 3H-TdR掺入法检测不同浓度白藜芦醇
对Hela细胞DNA合成的影响2.3 白藜芦醇对DNA合成S期的作用
流式细胞术检测细胞周期。应用不同浓度的白藜芦醇处理细胞12h、24h和36h后可以观察到，DNA合成S期明显延长并呈现出剂量相关性（图3）。
图3 流式细胞仪检测不同浓度白藜芦醇
作用不同时间后细胞周期的改变
3 讨 论
白藜芦醇是肿瘤疾病的化学预防剂，也是对降低血小板聚集，预防、动脉粥样硬化，心脑血管疾病的化学预防剂。现已发现其药理作用有：抑制血小板非正常凝聚，预防心肌梗死、脑栓塞，对缺氧心脏有保护作用，有效恢复烧伤或失血性休克引起的心输出量下降，并能够扩张动脉血管及改善微循环。
在本课题中，我们初步研究白藜芦醇对Hela细胞生长和存活，细胞周期的进行和凋亡等的影响。研究结果显示白藜芦醇在较低浓度(12.5 或 25 μM)时，细胞周期延长，增殖和DNA合成减缓，即可较快的（12h内）诱导较多Hela细胞S期停滞，但几乎没有增加细胞凋亡或死亡。白藜芦醇培养较长时间后，Hela细胞仍可通过S期进入正常的细胞周期循环，但如果继续加大白藜芦醇的浓度，不排除引起细胞凋亡或死亡的可能性。
总之，我们关于白藜芦醇的研究显示，S期停滞的诱导和DNA生物合成的抑制还不至于引起细胞毒作用和细胞死亡。提示合适浓度的白藜芦醇可作为肿瘤早期预防和延长生物体寿命的一个保护剂。
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[1] Roldán A, Palacios V, Caro I，et al.Resveratrol content of Palomino fino grapes: influence of vintage and fungal infection.[J]. J Agric Food Chem, 2003, 51: 1464
[2]Valenzano DR, Terzibasi E, Genade T, et al.Resveratrol prolongs lifespan and retards the onset of age?related markers in a short?lived vertebrate[J]. Curr Biol, 2006, 16: 296
[3] Malumbres M ,Barbacid M.Cell cycle kinases in cancer [J]. Curr Opin Genet, 2007, 17:60
[4] Liu J, Huang H, Xing X, et al.The Comparative proteomic analysis on human L-02 liver cells treated with varying concentrations of trichloroethylene [J]. Toxicol Ind Health, 2007, 23:91
[5]Kong L, Li Y, Yang Y, et al. Expression of fusion IL2?B7.1(IgV+C) and effects on T lymphocytes[J]. Biochem Cell Biol, 2007, 85:685
[6] lden C, Mellor N, Rees M, et al.Growth factors improve gene expression after lentiviral transduction in human adult and fetal hepatocytes [J]. J Gene Med, 2007, 9(2):67
