重组人生长激素受体胞外段及其突变体S201C

【摘要】  目的 研究重组人生长激素受体胞外段（rhGHRECD）与人生长激素（hGH）结合动力学。方法 用定点诱变PCR法获得rhGHRECD突变体S201C碱基序列。将测序正确的质粒pET20b(+)?hGHRECD、rhGHRECD（S201C）转入BL21（DE3）表达，纯化得到蛋白。采用放免分析法测定rhGHRECD、rhGHRECD（S201C）蛋白与hGH的结合解离常数（Kd）；采用BIAcore检测rhGHRECD（S201C）与hGH的结合动力学。结果 放免测得KdWT=1.879×10-10 M、KdS201C=1.937×10-10 M；BIAcore 测得结合速度（Kon）= 3.2 ×105 (M-1·s-1)， 解离速度（Koff）= 3.9 ×10-5 (s-1)，Kd=1.220 ×10-10M。 结论 rhGHRECD、rhGHRECD（S201C）与商品化的hGH具有极高的结合能力；rhGHRECD、rhGHRECD（S201C）与hGH结合，具有同样高的亲和力；rhGHRECD（S201C）可锚定于BIAcore芯片上，实时检测重组的hGH Site1与受体结合的动力学变化。

【关键词】  人生长激素受体细胞外段；人生长激素；突变体；表达；纯化

    ABSTRACT：Objective  To measure the kinetics of Recombinant Human Growth Hormone Receptor Extra?cellular Domain（rhGHRECD）and its mutant binding with the Human Growth Hormone（hGH）.Methods Get rhGHRECD (S201C) sequences was obtained site?directed mutagenesis from rhGHRECD. The plasmids including full?length cDNA of rhGHRECD and rhGHRECD (S201C) was transformed into E. coli BL-21(DE3) to be expressed and purified.  Their kinetics were measured when binding with hGH by Radio-immunity assay （RIA）. BIAcore 3000 was used to detect the kinetics of rhGHRECD (S201C) binding with hGH. Results RIA showed: KdWT =1.879×10-10 M, KdS201C =1.937×10-10 M. When rhGHBP?S201C binding with hGH ,we could get（Kon）= 3.2 ×105 (M-1·s-1), （Koff）= 3.9 ×10-5 (s-1) and Kd=1.220 ×10-10 M from BIAcore 3000.Conclusion Both rhGHRECD and rhGHRECD (S201C) can bind with commercial hGH well and they have the same affinity when binding to hGH. rhGHRECD (S201C) can detect the bioactivity of site1 of hGH real?timely when fixing to BIAcore 3000.

    KEY WORDS：Growth hormone;Growth hormone binding protein;Mutant;Expression; Purification

    生长激素 (growth hormone, GH) 发挥生理作用的第一步是与暴露于靶细胞膜表面的生长激素受体的细胞外段结合。通过一分子hGH与两分子hGHRECD结合，引起受体分子二聚及构型改变，引发信号转导，调节多种基因活动实现其多种功能[1]。人生长激素受体细胞外段(human growth hormone receptor extra?cellular domain, hGHRECD)， 即人生长激素结合蛋白（human growth hormone binding protein, hGHBP），是从细胞膜上受体分子经特异性蛋白酶剪切后释放的细胞外部分，存在于血浆和组织中。一般认为hGHBP主要功能是与血中游离的GH动态结合，显著延长GH的半衰期[2，3]。重组分子技术得到的hGHRECD其特异性、亲和力与体内天然的GHR膜外段完全相同,因此可以在体外实验中将其固定，从分子水平模拟受体与hGH结合的初始过程，分析其结合动力学变化[4],也可用来检测即将商品化的重组GH及其拟似剂的结合能力。

    1  材料与方法

    1.1  材料与设备

    质粒pET20b(+)?rhGHRECD、大肠杆菌DH?5α及BL?21（DE3）由本室－89 ℃甘油冻存 ；pfu酶购自Stratagene；Q?sepharose F.F购自Pharmacia;层析系统购自上海沪西分析仪器厂; IPTG购自上海生物工程有限公司;PEG?600购自武汉联合化工；牛血清球蛋白 (bovine gamma gloubine，BBG)购自Sigma;人生长激素放免试剂盒购自北京北方生物所。

    1.2  方法

    1.2.1  hGHRECD C末端的定点突变

    按照PCR定点突变引物设计原则, 根据突变体模板的基因序列设计一对方向相反的引物P1和P2, 引入同一个突变位点。即：分别将hGHRECDC末端的第201位编码丝氨酸的TCC用编码半胱氨酸的密码TGC置换。引物分别是P1?S201C：5'?GTTCCAGTGTACTGCTTGAAAGTGGATA?3', P2?S201C：5'?ATCCACTTTCAAGCAGTACACTGGAACTG?3'；在pfu DNA聚合酶的作用下进行PCR， 25次循环后，取PCR产物5 μl做1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

    1.2.2  突变体的鉴定

    PCR产物经Dpn I 酶消化模板后，用无水乙醇和乙酸钠抽提纯化送上海基康公司测序。

    1.2.3  rhGHRECD与rhGHRECD（S201C）的表达

    将测序正确的pET20b(+)?rhGHRECD、pET20b(+)?rhGHRECD（S201C）质粒转入BL21（DE3），1.5 L 的2YT培养基培养3～4小时( 200rpm, 37℃)，待OD600达0.8时加IPTG至终浓度1mM，诱导3～4h后离心收集菌体, 加入PMSF(终浓度1mM)，保存于－89℃备用。分别采集诱导前后样本做还原性SDS?Page。

    1.2.4  rhGHRECD、rhGHRECD（S201C）蛋白的纯化

    菌体解冻后进行超声破碎，结晶紫染色鉴定细菌破碎程度。4 ℃离心收集沉淀后立即加入200 ml洗液 I (25mM NaBO3、0.5M NaCl pH 9.1)溶解洗涤,  离心后再用100ml洗液II(含1 MUrea,10% Triton X?100 100μl 的PBS， pH7.6)重悬沉淀。

    上两步可得到较纯的包涵体，再在400ml的40mM Tris.cl, 4.5M Urea, pH 10.3的碱性溶液中变性 30～36 h后透析36h(10mM Tris.cl, pH 8.10 )， 12h换液1次。复性后的粗提液与填料Q?sepharose F. F. 充分结合, 装载后用10mM Tris.cl (pH 8.10) 平衡1h，用0～1M NaCl 进行梯度洗脱，流速为2 ml/min，自动收集洗脱峰。  SDS?Page鉴定各收集管蛋白。

    1.2.5  rhGHRECD、rhGHRECD（S201C）蛋白与hGH 活性的鉴定

    放射免疫分析法测定不同浓度的rhGHRECD、rhGHRECD（S201C）蛋白 与125I?hGH 反应的平衡解离常数（Kd）。Biacore系统检测rhGHRECD（S201C）与hGH生物分子间相互作用。进一步得到两者结合的动力学指标。

    1.3  统计学处理

    各浓度管数据（cpm）均以 ± s 处理。运用软件 Prism3.0 分析。以浓度的对数值为横坐标[lgC(ng/ml)]，各浓度管放射计数取均数与最大结合计数比值为纵坐标（B/B0，100 %），绘制固定量125I?rhGH和不同浓度的rhGHRECD、rhGHRECD（S201C）的结合曲线。

    2.1  PCR结果

    采用对热稳定、高保真的pfu DNA聚合酶，以pET20b(+)?hGHRECD为模板，P1、P2引入定点的突变，在合适的反应体系和条件下，在 5148bp和4269bp间出现特异性条带，同空白阳性对照位置一致（图1）。产物抽提后测序并比对，发现pET20b(+)?hGHRECD碱基序列上仅第201位编码丝氨酸的TCC已经被半胱氨酸的密码字TGC置换。

    2.2  目的蛋白的表达、纯化 （以rhGHRECD纯化过程结果为例）

    从图2可见，目的蛋白表达诱导前后差异明显。处理得到的包涵体依次经过变性、复性过程后，目的蛋白泳带位置未发生改变。

    图2  hGHRECD表达与粗提

    1分子量marker；2诱导前；3诱导后；

    4包涵体；5变性后；6复性后2.3  离子交换层析

    离子层析过程中，对应第一个洗脱蜂出现时自动收集得到的5、6管蛋白浓度最高。而后逐下降，非特异条带开始出现并增多，见图3，4。

    图3  hGHRECD层析谱图

    图4  hGHRECD离子层析后收集液电泳图

    1分子量marker；2～9各收集管蛋白液2.4  放射免疫鉴定生物学活性       

    从图5、图6中可见，随着反应体系中rhGHRECD、rhGHRECD（S201C）浓度的增加，与125I?rhGH结合的量逐渐上升。通过软件可：KdWT=1.879×10-10 M，KdS201C=1.937×10-10 M。

    图5  hGHRECD与125I?hGH结合曲线

    图6  hGHRECD（S201C）与125I?hGH结合曲线2.5  结合动力学分析

    图7  hGHRECD（S201C）与hGH结合与解离过程图7显示，不同浓度的hGH与锚定在BIAcore生物芯片上的rhGHRECD（S201C）结合的动力学变化。在这个结合过程中， hGH浓度越高, 曲线上升的速度越快，提示hGH与rhGHRECD（S201C）的结合速度（Kon）越快；在结合持续380s后，注射缓冲液洗掉体系中非稳定结合及多于的hGH分子，曲线仍保持平稳，表明两者结合稳固，解离速度（Koff）极慢。通过BIA evalution 3.0自动分析得到其结合速度（Kon）= 3.2 ×105 (M-1·s-1)， 解离速度（Koff）= 3.9 ×10-5 (s-1)，Kd=1.220 ×10-10 M。

    3  讨  论

    人生长激素受体胞外段分子折叠成两个结构极其相近的功能域。氨基末端的第1到123位氨基酸残基是与GH的结合域，其中有三个二硫键对维持其结合功能至关重要，第128到238位氨基酸则是两个GHBP分子联结的部位[1,2]。人生长激素分子表面存在一个高亲和力的结合位点（Site l）和一个低亲和力的结合位点（Site 2）。高亲和力的Site l 能快速与GH受体1（GHR 1）外段结合而被吸附到细胞膜上，低亲和力的Site 2再与GHR2外段结合并诱导两个受体分子的二聚（或使已经二聚的受体发生构型改变），从而激活受体[5]。万瑜等学者的研究发现突变猪生长激素中的某些氨基酸，增加Site1的亲和力后，能提高其生物学活性5倍以上[4]。本研究采用浓度梯度结合方法，测定hGHRECD、hGHRECD（S201C）与hGH结合的动力学指标。结果显示此法获得的hGHRECD、hGHRECD（S201C）蛋白可以和hGH较好的结合，且结合的量随浓度递增，解离常数分别为：KdWT=1.879×10-10 M、KdS201C=1.937×10-10 M，两者的Kd值和报道的数值相符[7,8], 且hGHRECD201位S 突变成C时不影响它与hGH的结合能力。
;   选择把rhGHRECD的201位的丝氨酸突变成为半胱氨酸，原因主要有3个方面： ①BIAcore生物芯片膜上有氨基(－NH2) 、羧基（COOH?）和巯基（?SH）等，可通过化学键将配基（受体、抗体等）固定到芯片表面，但由于rhGHRECD分子表面存在多个?NH2（如Arg、Lys侧链上的游离氨基） 、COOH?（如Glu、Asp侧链上的游离羧基）基团，故只有在hGHBP分子中制备唯一的游离巯基（201位Cys）才可能使所有的rhGHRECD分子以相同的方位和空间构型锚定于BIAcore生物芯片表面。②201位的丝氨酸在rhGHRECD羧基末端，将其突变成为半胱氨酸并锚定于芯片表面时，其伸展的方位与空间构型近似于在体环境。③在GHR，第201位的丝氨酸突变将导致受体不能完全二聚，但不影响hGH的Site1和受体1∶1比例的结合[2,5]。因此可用rhGHRECD（S201C）来准确检测hGH（或重组GH）的 Site1与GHR1的结合能力，而hGH Site2结合GHR2分子的反应为研究其亲和力与信息传递机制，制备高效能的GH奠定基础 [8]。

【文献】
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