解毒化瘀方对脓毒症大鼠蛋白C mRNA表达及血浆蛋白C活性的影响

【摘要】  目的 观察解毒化瘀方对脓毒症大鼠凝血调节蛋白C mRNA (PC mRNA)表达及血浆蛋白C(PC)活性的影响，并探讨中药解毒化瘀方脓毒症的作用机制。方法 将大鼠分为正常组、对照组（假手术处理）、模型组（脓毒症）、中药组（造脓毒症模型前后用解毒化瘀方治疗），动态观察术后12、24、48?h及正常组肝脏组织PC mRNA表达及血浆PC活性、内毒素（LPS）水平。采用盲肠结扎穿刺法复制脓毒症模型、实时荧光定量PCR法检测PC mRNA表达、血凝仪法检测血浆PC活性，动态浊度鲎试验法检测LPS水平。且动态观察解毒化瘀方对脓毒症大鼠生存率的影响。结果 在脓毒症形成过程中，模型组PC mRNA表达水平和血浆PC活性均显著低于正常组及对照组（P＜0.01），而血浆LPS水平则显著高于正常组与对照组（P＜0.01）；经解毒化瘀方治疗的脓毒症大鼠，其PC mRNA表达及血浆PC活性均显著高于模型组（P＜0.01），血浆LPS水平则显著低于模型组（P＜0.01）；经解毒化瘀方治疗的脓毒症大鼠，其生存率亦高于未治疗的脓毒症大鼠（P＜0.05）。结论 解毒化瘀方能增强脓毒症大鼠PC mRNA表达，提高血浆PC活性，降低血浆LPS水平，提高了脓毒症大鼠的生存率。

【关键词】  脓毒症； 解毒化瘀方；蛋白C；大鼠，Wistar

　　To explore the changes of expression of coagulation regulating protein C mRNA (PC mRNA) and activity of plasma protein C (PC)  in septic rats treated with Jidu Huayu Recipe(JHR). Methods  Wistar rat sepsis models were induced by cecal ligation and puncture.  The Wistar rats were divided into the normal group(NP), the control group(CP), the model group(MP) and the traditional Chinese medicine treated group(TCMP). The expression of Protein C mRNA and the activity of plasma PC and LPS were dynamically determined at  12?h, 24?h, and 48?h after the sepsis operations by real?time quantitative RT?PCR and by the automated coagulation analyzer and Limulus test. The effect of JHR on the survival rate was also dynamically observed. Results  In the course of sepsis, the expression of protein C mRNA and the activity of plasma PC in the MP group were lower than those in the CP and NP groups（P ＜0.01）, but the LPS level was increased（P＜0.01）. The expression of protein C  mRNA and the activity of plasma PC in the TCMP group were higher than that in the MP group（P ＜0.01）, but the LPS level was decreased（P＜0.0 1）.　The survival rate of the septic rats treated with JHR was obviously higher than that of those without JHR treatment （P＜0.05）.　Conclusion  JHR could  improve the expression of protein C mRNA and the activity of plasma PC and reduce the plasma LPS level of septic rats , which improves the survival rate of septic rats. This may be one of the molecule bases of JHR in treating sepsis.

　　Key words： Sepsis;  Jiedu huayu recipe;  Protein C;  Rats， Wistar  
 
　　脓毒症（sepsis）是指微生物入侵机体感染后所致的全身性炎症反应综合征。近年来在研究脓毒症的病理变化中，发现广泛性毛细血管内凝血是造成诸如中毒性休克和多器官功能障碍的重要原因［1］，但这种现象发生的分子机制尚未阐明。鉴于抗生素不能清除内毒素，因此目前治疗大多是以对症为主的综合治疗，无确切有效的治疗措施［2］。本研究用解毒化瘀中药治疗脓毒症大鼠，从血浆蛋白C的活性及mRNA的表达入手，揭示脓毒症广泛性毛细血管内凝血发生的病理生机制，从而为脓毒症的中西医结合防治提供新的切入点。

　　1  材料与方法

　　1.1  动物及分组

　　雄性Wistar大鼠190只，购自山东大学实验动物中心，体重250～300?g，8周龄,分为4组，分别为正常组16只，对照组48只（12、24 、48?h各16只），模型组48只（12、24 、48?h各16只），中药组48只（12、24、48?h各16只）。剩余30只比较生存率。

　　1.2  仪器与试剂

　　LineGene FQD?33A荧光定量PCR仪, 杭州博日公司。总RNA提取试剂盒, 美国Promega 公司。Ex ScriptKit(反转录反应试剂盒)，SYBR Premix Ex TaqKit （荧光定量PCR专用试剂盒），DNA Fragment Purification Kit，均为日本TaKaRa公司产品。高速冷冻离心机，上海仪器厂。PC活性检测试剂盒,美国 Biopool公司。Compact XR全自动血凝仪，德国BE公司。DS?99细菌内毒素检测系统,湛江正杰科学仪器有限公司。

　　1.3  解毒化瘀方制备

　　本着清热解毒、活血化瘀、凉血开窍原则制定，选择醒脑静注射液和中药煎剂共同组成，醒脑静注射液，10?mL/支，含麝香75?mg、栀子300?mg、郁金300?mg、冰片100?mg，大理药业有限公司生产，批号：051012。每剂中药煎剂由地龙5?g、生水蛭5?g、土元5?g、板兰根20?g、生大黄5?g、丹皮10?g、赤芍10?g、丹参20?g、川芎10?g、生地10?g、生石膏10?g、金银花10?g、红花10?g、连翘10?g、枳实10?g、蒲公英10?g组成，购自济南建联中药公司，水煎2遍，浓缩至120?mL，生大黄于浓缩后期放入。

　　1.4  模型制作与取材

　　正常组：正常饲养，不做手术处理，1周后取材。模型组：造模前7?d开始给于生理盐水灌胃，1.5?mL/100?g体重,12?h 1次；生理盐水腹腔注射，0.39?mL/100?g体重，12?h 1次，按照 Hubbard WJ等［3］报道的方法复制脓毒症大鼠模型，以5%氯胺酮(0.2?mL/100?g体重)腹腔麻醉，沿腹正中线作1.5?cm切口，找到盲肠，剥离肠系膜，在盲肠根部结扎盲肠，用5?mL注射器针头穿刺盲肠3次。将盲肠还纳腹腔，逐层缝合腹壁切口，皮下注射生理盐水10?mL抗休克，术后灌胃和腹腔注射同术前。对照组：假手术处理，除不结扎穿刺外，其余过程同模型组。中药组：造模手术同模型组，于造脓毒症模型前7?d开始给于中药煎剂灌胃，1.5?mL/100?g体重,12?h 1次，醒脑静注射液腹腔注射，0.39?mL/100?g体重，12?h 1次，术后继续给药。

    造模成功后，各组在相应时点随机选8只，经心脏采血1.8?mL，加入盛有0.2?mL 3.8%的枸橼酸钠的试管中离心，血浆置-70?℃保存，供血浆PC活性、LPS水平检测。随即开腹，取肝脏，切成0.5?cm×0.5?cm×0.5?cm大小放入盛有5倍体积的RNA组织保存液的带盖塑料试管中保存，供PC mRNA定量。

　　1.5  实时荧光定量PCR法检测肝脏组织PCmRNA定量

　　荧光染料采用SYBR GreenⅠ，登陆GenBank获得大鼠PC mRNA及看家基因三磷酸甘油脱氢酶（GAPDH）mRNA序列，利用软件Primerr 5.0设计适合SYBR GreenⅠ荧光定量PCR的特异性引物，由大连TaKaRa公司合成。引物序列分别为PC：5＇?AAATGGCGGCTGCTACCACTAC?3＇，5＇?TCTGGGTCTATGTCCCGTTTGAA?3＇;  GAPDH：5＇? GACAACTTTGGCATCGTGGA ?3＇， 5＇? ATGCAGGGATGATGTTCTGG?3＇。RT?PCR严格按实时荧光定量试剂和仪器说明书进行操作。以实时荧光定量PCR测出的PC mRNA起始拷贝数与看家基因GAPDHmRNA的起始拷贝数的比值作为该基因mRNA的表达量［4?5］。

　

　1.6  大鼠血浆PC活性、LPS水平检测
 
　　分别采用血凝仪法，动态浊度鲎实验法。按试剂盒说明书和仪器操作程序进行检测。

　　1.7  生存率观察

　　雄性Wistar大鼠30只。随机分为模型组、中药组，每组15只，手术和过程同1.4。动态观察两组5?d内的存活情况。

　　1.8   统计学处理

　　计量资料用±s表示，采用t检验,生存率的比较采用Log?Rank检验，用SPSS统计软件完成。

　　2  结  果

　　2．1  各组大鼠肝组织PC mRNA表达、血浆PC活性、LPS水平的比较

　　见表1。对照组各时点每项指标与正常组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组12、24、48?h血浆LPS水平均显著高于对照组各时点及正常组（P＜0.01）。中药组各时点的血浆LPS均显著低于模型组各时点（P＜0.01）。模型组12、24、48?h肝组织 PCmRNA表达均显著低于对照组各时点及正常组（P＜0.01），其中以24?h组降低幅度最大。中药组 PC mRNA在各时点的表达均显著高于模型组各时点（P＜0.01）。模型组12、24、48?h血浆PC活性均显著低于对照组对照组各时点及正常组（P＜0.01），其中以术后48?h组降低幅度最大。中药组PC在各时点的活性均显著高于模型组各时点（P＜0.01）。说明脓毒症存在PC mRNA过低表达、PC活性下降，解毒化瘀方能提高PC mRNA表达、PC活性，降低LPS水平。表１生存率中药组生存数生存率（略）

　　3  讨  论

    内毒素（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成份，化学成份是脂多糖。在脓毒症过程中，血管内皮细胞、单核细胞在LPS等炎症介质的诱导下可表达组织因子［6］,从而启动外源性凝血途径，引起血管内凝血（DIC）。反之，凝血异常也可促进炎症的，加剧脓毒症的发展［7］，因此，脓毒症往往伴随凝血系统的异常。PC系统凝血系统的一个重要调节因子，具有阻止凝血系统活化、抑制凝血酶生成、促进纤溶的功能。PC还可抑制内毒素模型中促炎症细胞因子的生成、缩短全身炎症反应期，还具有保护血管内皮、减缓多脏器功能障碍的作用［8］。本研究采用了目前国内外普遍采用的脓毒症造模方法，造模后血液LPS水平显著升高，说明造模是成功的。本研究结果表明，在脓毒症过程中，蛋白C系统在基因表达的mRNA水平和血浆蛋白水平降低。
   
　　中医学认为，脓毒症为邪毒入侵（严重感染）导致热毒炽盛，毒热入血，血热互结，败血阻滞，瘀血产生，毒瘀并存，最终致出血、休克昏迷症状［9］。以清热解毒、活血化瘀，凉血开窍为治则组成解毒化瘀方。 先前的研究表明板兰根、生大黄、生石膏、金银花、连翘、公英、栀子具有抗多种病原微生物、抗内毒素、抗炎症反应作用，地龙、生水蛭、土元、丹皮、红花、赤芍、丹参、川芎、郁金、生地能改善微循环、延长凝血酶时间、增强纤溶酶原激活物活性，抑制血小板聚集、降低血小板黏附性，防止微血栓形成，故具有溶栓和抗凝作用；麝香可以改善循环，并有显著的抗炎症反应作用；冰片有明显的杀菌、抗炎症反应及促进药物吸收作用。麝香、生地、枳实还具有升压、强心、抗休克作用［10］。

　　本研究采用实时荧光定量PCR法检测显示，脓毒症大鼠凝血调节蛋白C基因表达及PC活性下降。解毒化瘀方通过增加PC基因表达、提高血浆PC活性，提高了脓毒症大鼠生存率，达到治疗脓毒症的目的。　　

 

【】
  　　［1］Bernard G R, Vincent J L, Laterre P F, et al. Efficacy and safety of recombinant human activated protein C for severe sepsis［J］. N Engl J Med, 2001, 344(10):699?709.

　　［2］Van der Poll T, Levi M, Nick J A, et al. Activated Protein C Inhibits Local Coagulation after Intrapulmonary Delivery of Endotoxin in Humans［J］. Am J Respir Crit Care Med, 2005, 33（1）：50?57.

　　［3］Hubbard W J, Choudhry M, Schwacha M G, et al. Cecal ligation and puncture［J］. Shock, 2005, 24（1）:52?57.

　　［4］Lekanne Deprez R H, Fijnvandraat A C, Ruijter J M, et al. Sensitivity and accuracy of quantitative real?time polymerase chain reaction using SYBR green Ⅰ depends on cDNA synthesis conditions［J］. Anal Biochem, 2002, 307(1):63?69.

　　［5］Bengtsson M, Karlsson H J, Westman G, et al. A new minor groove binding asymmetric cyanine reporter dye for real?time PCR［J］. Nucleic Acids Res,　2003, 31(8):e45.

　　［6］Napoleone E, DiSantoA, BastoneA, et al. Long pentraxin PTX3 upregulates tissue factor expression in human endothelial cells［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol,　2002,　22:782?787.

　　［7］Levi M, Tymen T, Keller, et al. Infection and inflammation and the coagulation system［J］. Cardiovascular Res, 2003,　60（1）:26?39.

　　［8］武子霞, 李银平, 姚永明. 活化蛋白C的生物活性及其作用机制研究进展［J］. 危重病急救医学, 2007,19(3):182?185.

　　［9］王今达, 李志军, 李银平. 从“三证三法"辨证论治脓毒症［J］. 中国危重病急救医学,2006,18（11）：643?644.

　　［10］颜正华,主编.中药学［M］.第2版.北京:人民卫生出版社, 2006： 135?841.