胃粘膜Ki-67表达与Ｈｐ感染及癌变的关系探讨

【摘要】  目的 探讨胃上皮细胞增殖与幽门螺杆菌(Ｈｐ)感染的关系及Ｈｐ感染致癌的可能机制。方法 应用特殊染色法将各种病变分为Ｈｐ感染阳性组和阴性组,应用免疫组化对各组病变的增殖细胞核抗原Ki-67表达进行检测。结果 总体上看,Ｈｐ阳性组Ki-67表达的阳性率明显高于Ｈｐ阴性组;且Ｈｐ阳性组总体Ki-67表达的阳性率明显高于Ｈｐ阴性组总体(Ｐ<0 05); Ki-67表达的阳性率随病变程度的加重而逐渐增加。结论 Ｈｐ感染可促进胃上皮细胞过度增殖,这种过度增殖可能是Ｈｐ感染致胃癌的机制之一。

【关键词】  Ki-67 幽门螺杆菌 癌变

　　【Abstract】Objectives  To explore the relationship among the cell proliferation 、helicobacter pylori( HP) infection and cancerization after HP infection. Methods  The expression of Ki-67 in gastric epithelial cell was examined with immunohistochemical technique and divided into different grade according to percentage and staining intensity of positive cell. Results  Of all pations ,the expressions of Ki-67 in the HP positive group was significantly higher than that in the HP negative group . The expression of Ki-67 was increased as the pathogenetic condition got worse. Conclusions  HP infection, as a risk factor for gastric carcinoma ,is associated with proliferation of gastric epithelial cells, which might be one of the pathogenesis of gastric carcinoma after HP infection.

　　【Key words】Ki-67  helicobacter pylori (HP)  carcinogenesis   

　　细胞增殖性的增加被认为是肿瘤发生的早期生物学改变之一，从慢性浅表性胃炎(ＣＳＧ)、慢性萎缩性胃炎(ＣＡＧ)、肠上皮化生(ＩＭ)、不典型增生(Ｄｙｓ)到胃癌(ＧＣａ)的演变过程是肠型胃癌发生的基本。幽门螺杆菌(Ｈｐ)感染为慢性胃炎的主要病因,所以Ｈｐ感染与胃癌的发生亦有密切的关系。因此,研究胃粘膜上皮细胞增殖与Ｈｐ感染的关系具有重要的理论意义。笔者通过免疫组化方法对Ｈｐ感染组和非感染组的ＣＳＧ、ＣＡＧ、ＩＭ、Ｄｙｓ及ＧＣａ的胃粘膜上皮细胞增殖细胞核抗原(Ki-67)表达进行检测,以探讨胃上皮细胞增殖与Ｈｐ感染的关系,并且进一步分析Ｈｐ感染在胃癌的发生过程中的生物学意义。

　　1  对象与方法

　　1.1  研究对象 

　　标本来自1995年～2005年间本院病理科石蜡包埋组织标本。其中慢性浅表性胃炎(CSG)160例,慢性萎缩性胃炎(CAG)160例,非典型增生(DYS)80例,胃癌(GC)120例,所有病例均具备完整的临床病理资料。所有标本均行连续切片,片厚6μm,每例取3张切片,其中一张做HE染色,一张用于特染Hp,一张用于免疫组化方法检测Ki-67。

　　1.2  主要试剂 

　　Hp特染主要试剂包括1%硝酸银、2%硝酸银、0.1%甲苯胺蓝染液和醋酸盐缓冲液。免疫组化主要试剂包括Ki-67免疫组化试剂盒(福州迈新公司)、0.1M枸橼酸盐缓冲液、DAB显色剂(福州迈新公司)。

　　1.3  Hp检测方法及阳性结果判定分别采用常规HE染色、Warthin-Starry(W-S)银染法和甲苯胺蓝法检测Hp的感染情况。经常规HE染色、W-S染色、甲苯胺蓝染色后确认Hp感染有两项以上为阳性者为Hp阳性组,均阴性者为阴性组,单项阳性者退出该实验。HE染色Hp为淡紫色,W-S法染色Hp为棕黑色,甲苯胺蓝染色Hp为蓝色。

　　1.4  Ki-67检测及阳性结果的判定采用SABC免疫组化法，检测Ki-67的表达,一抗为小鼠抗Ki-67抗体,阴性对照用PBS代替一抗,用已知阳性切片作为阳性对照。镜下观察为细胞核着色,呈深浅不一的棕黄色颗粒的细胞为阳性细胞。根据染色反应的深度及阳性细胞的数量分别记分为0～3分,其中染色深度以多数细胞的呈色反应为准,浅黄色为1分,深黄色为2分,棕黄色为3分,不着色为0分。阳性细胞数<10%为0分,10%～45%为1分,46%～70%为2分,>70%为3分,并根据这两项的积分之和分为4级即:阴性(-)为0分,弱阳性(+)为1～2分,阳性(++)为3～4分,强阳性(+++)为5～6分。阳性细胞率的是先在低倍镜下随机选取细胞分布均匀的视野,再在高倍镜下用PAS病理彩色图像分析系统进行图像分析,每例计数500个细胞,然后测出阳性细胞的百分率:阳性细胞率=(阳性细胞数/500)×100%。

　　1.5  统计分析 

　　数据库建立和数据分析采用SPSS-11.0软件处理,以χ2检验进行统计分析。

　　2  结果

　　2.1  在不同胃粘膜病变中,Hp主要存在于胃粘膜表面的粘液中、细胞的表面、胃小凹内、腺腔中及癌旁粘膜,呈弯曲状、海鸥状及杆状,往往聚集成群,而癌组织内却少见Hp。在CSG、CAG、DYS及GC中Hp的感染率分布情况,分别为60%、40%、70%、72.5%(图1-2)。经统计学分析,GC与CSG相比,Hp的感染率有显著差异(P<0.05)。见表1。
表1  不同类型胃粘膜病变Hp的感染率（略）

　　2.2  Ki-67在不同胃粘膜病变中的表达情况  Ki-67主要在癌组织中的癌细胞核表达,在CSG,CAG,DYS,GC中Ki-67阳性率分别为5.00%、25.00%、50.00%、和62.50%。经统计分析, Ki-67阳性率GC与CSG、CAG相比具有显著性差异(P<0.01)。见表2。表2  不同类型胃粘膜病变的Ki-67表达情况（略）

　　2.3  Hp阳性组和Hp阴性组胃癌标本ki-67的表达情况,见表3。由表3可见,在120例胃癌标本中,Hp阳性组ki-67的阳性表达明显高于Hp阴性组(P<0.05)。表3  ki-67的阳性和阴性胃癌中的表达情况（略）

　　3  讨论

　　3.1  Hp感染在胃粘膜上皮癌变过程中的作用 

　　90年代以来,在人群中具有较高感染率的Hp与胃癌关系已受到广泛的关注,目前大多数学者认为胃癌可能是Hp长期感染与其他因素共同作用的结果。Hondans等人［１］用Hp感染蒙古沙鼠于1～1.5年之后成功诱发了胃癌,并经历了炎细胞浸润→萎缩性胃炎→肠上皮化生→异常增生→胃癌的演变过程,在这一演变过程中Hp可能起着先导作用。现在WHO已将Hp列为一类致癌原［２］,本研究实验结果显示:在不同病变类型中Hp存在于胃粘膜的表面粘液中、细胞的表面、胃小凹内、腺腔中以及癌旁组织中,而癌组织内少见Hp,其可能原因是癌组织中的微环境不适合于细菌生长,或者是胃癌组织释放了某种破坏因子使局部Hp破坏崩解所致［３］。在萎缩性胃炎中,萎缩区域由于生化环境变化不利于螺旋杆菌生长,检测到数量有所减少,但其周围浅表性胃炎粘膜HP感染率并不低,而且在实际临床病人胃粘膜病变往往是浅表与萎缩并存.本研究发现胃癌患者Hp感染率明显高于浅表性胃炎和萎缩性胃炎,表明Hp感染与胃癌的发生存在密切关系,并且在不同类型胃粘膜病变中,随着病变的加重Hp感染率逐渐升高趋势,因此说明Hp感染可能在浅表性胃炎→萎缩性胃炎→肠上皮化生→异常增生→胃癌这一演变过程中起着重要作用。

    而胃粘膜上述系列病变演变过程中,主要的生物性改变是上皮细胞增殖性的增加,特别是细胞核的生化性增殖性改变,Ｋｉ-67是一种贯穿表达于增值期细胞中的核抗原,可以准确反映细胞的增值活性是一个较理想的反映细胞增值活性的标志物［４］Ｋｉ-67抗原基因定位于第10号染色体,其表达在细胞的Ｇ1、Ｓ、Ｇ2、Ｍ期,但在Ｇ0期无此抗原表达,是由分子量为345ＫＤ和395ＫＤ两条多肽链组成的核蛋白, 它在Ｇ1期开始出现,在Ｓ期和Ｇ2期逐渐升高,Ｍ期达到高峰,有丝分裂结束后迅速降解消失,Ｇ0期无表达［５］。近年来,国内外报道多种恶性肿瘤中均有Ｋｉ-67的过度表达,因此推测Ｋｉ-67可能是一种原癌基因,过度表达可导致肿瘤的发生。

    胃癌的发生是逐渐演变的过程，从萎缩性胃炎、肠上皮化生、到重度不典型增生，直至癌变,从本研究中可明显看到HP感染是胃癌发病的因素之一, 在癌前病变阶段，长期持续的HP感染可促进Ｋｉ-67的过度表达，其中的推测理由是幽门螺杆菌释放的脂多糖、尿素酶、空泡毒素与粘附素等重要的定殖致病因子刺激胃上皮细胞受体,宿主会出现胃泌素和(或)生长抑素分泌紊乱、炎性介质释放、氧自由基形成、胃粘膜疏水性下降、胃上皮细胞增殖与凋亡失衡、癌基因与抑癌基因突变等改变［６］。本研究说明:胃癌发生与ＨＰ感染有密切相关性,ＨＰ感染可能是导致胃癌发生的一个重要因素。在胃癌的防治工作中,要加强对幽门螺杆菌感染的防治。

【文献】
  　　1 Hondas，FujinkaT，Tokieda，Metal.Development of Helicobacterpylori induced gastriccarcinoma in Monogoliangerbils. Cancer Res,1998,58:4255～4299.

　　2 范学工,夏华向.幽门螺杆菌感染-基础与临床.湖南技术出版社,1997.102.

　　3 汪荣泉,房殿春,刘为纹,等.幽门螺杆菌感染与胃癌及癌旁组织中MUCI和MUC6基因表达的关系.世界华人消化杂志,2000,8:584～587.

　　4 Fonatsch C，Duchrow M，Rieder H，et al，Assignment of the human Ki-67gene(MK167) to 10q25-qter.Genomics，19111(2):476～477.

　　5 Gendes J，Iemke H，Baish H，et al.Cellcycle analysiso face II proliferation associated human huclear antigen defined by the monoclonalantibody Ki-67.Jimmunol,1984,133(4):1710～1715.

　　6 关于幽门螺旋杆菌若干问题的意见（草案）.中华消化杂志1997，17：287～288.