两种二巯丁二酸胶囊人体生物等效性研究

              作者：刘世军 肖红 居学海 刘宪勇 褚志杰 张敏  

【摘要】  　　目的 研究2种二巯丁二酸胶囊的人体生物利用度和药动学特征。方法 20名健康男性受试者采用单剂口服两交叉两周期试验设计，分别口服单剂量500 mg 2种二巯丁二酸胶囊。采用HPLC?荧光检测法测定血液样品中的二巯丁二酸浓度。结果 试验制剂和参比制剂主要药代动力学参数：t1/2分别为(7.94±2.16) h和(7.48±2.19) h，Tmax分别为(2.45±0.22) h和(2.48±0.34) h，Cmax 分别为(3.77±1.29) μg·ml-1和(3.70±0.95) μg·ml-1，AUC0?24分别为(24.35±7.56) μg·ml-1·h-1和(24.52±6.79) μg·ml-1·h-1，AUC0?∞分别为(27.64±8.64) μg·ml-1·h-1和(27.91±8.83) μg·ml-1·h-1。试验制剂相对生物利用度F为(99.00±11.42)%。试验制剂和参比制剂主要药动学参数药物间和周期间无显著性差异(P＞0.05)，但个体间存在差异(P＜0.05)。结论 2种二巯丁二酸胶囊具有生物等效性，但存在个体差异，临床应用时应注意个体化给药方案。

【关键词】  二巯丁二酸； 药动学； 生物利用度； 高效液相色谱法

    【Abstract】  Objective  To observe the bioavailability of two kinds of succimer capsules and characteristics of pharmacokinetics. Methods  A single oral dose of 500 mg succimer capsule was given to 20 healthy volunteers in a randomized crossover study. succimer concentrations in blood were determined by HPLC?fluorescence detection method. Results  The main pharmacokinetics of the two products were as follow: t1/2 (7.94±2.16) h and (7.48±2.19) h, Tmax (2.45±0.22) h and (2.48±0.34) h, Cmax (3.77±1.29) μg·ml-1 and (3.70±0.95) μg·ml-1, AUC0-24 (24.35±7.56) μg·ml-1·h-1 and (24.52±6.79) μg·ml-1·h-1, AUC0-∞ (27.64±8.64) μg·ml-1·h-1 and (27.91±8.83) μg·ml-1·h-1 respectively. The relative bioavailability of two products was (99.00±11.42) %. No significant difference between the parameters of two products (P＞0.05) was found, however, there was significant difference among individual volunteers(P＜0.05). Conclusion  The results demonstrated that the two products were bioequivalent. There was individual variation between volunteers, so dosage regimen should be individualized.

    【Key words】  Succimer； Pharmacokinetics； Bioavailability； HPLC

    二巯丁二酸是一种金属螯合剂，临床用来重金属中毒，如铅、汞、砷、镍、铜等，其中对铅中毒疗效较好。1991年，美国FDA正式批准二巯丁二酸作为口服驱铅治疗药物，应用于儿童铅中毒的治疗［1，2］。本研究对山东达因海洋生物制药股份有限公司和上海新亚药业闵行有限公司生产的二巯丁二酸胶囊进行生物利用度比较，并对其生物等效性做出评价，以期为临床用药提供药动学依据和质量保证。

    1  材料与方法

    1.1  药品与试剂  试验制剂二巯丁二酸胶囊(T)，规格0.25 g/粒(山东达因海洋生物制药股份有限公司提供，批号050901)。参比制剂二巯丁二酸胶囊(R)，规格0.25 g/粒(上海新亚药业闵行有限公司生产，批号040305)。二巯丁二酸试验制剂和参比制剂经山东达因海洋生物制药股份有限公司检验，性状、鉴别、溶出度、重量差异、含量等均合格，符合试验要求。二巯丁二酸对照品，纯度98%(美国Sigma公司，批号D7881?1G)。

    1.2  仪器  日本SHIMADZU 高效液相系统，包括SCL?10AVP控制器，LC?10ATVP泵，RF?10AXL，7725I进样阀，LC Solution工作站；HT?230A色谱柱恒温箱(天津市恒奥科技有限公司)；METTLER TOLEDO AX?205天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；XW?80A型旋涡混合器(上海精科实业有限公司)；PROINO离心机(美国科峻仪器公司)；PK514BP超声波清洗器(德国BANDEL)。

    1.3  研究对象  20名男性健康志愿者，均为在校大学生；年龄(23.1±1.94)岁，体重(65.8±6.47)kg；不吸烟、不酗酒；无心、肝、肾、消化道及代谢异常等病史；无药物过敏史和神经系统疾病史；无急、慢性疾病及家族遗传病史；试验前2周内未服用其他药物；无影响药物吸收、分布、排泄和代谢等因素；3个月内未服用过已知对某脏器有损害的药物以及未参加过其他药物临床试验；体格检查(心电图、肝功能、肾功能及血、尿常规等)合格。试验前书面告知志愿者试验的目的、方法、试验制剂的药理特性、可能发生的药物不良反应、受试者权益，并签定书面知情同意书。

    1.4  给药方式  采用单剂口服两交叉两周期试验设计。20名受试者按体重配对随机分为两组，两组受试者个人资料及实验室检查数据经统计学分析无显著性差异，条件相当。周期间清洗期为1周。受试者于试验前1 d晚10时后禁食，试验当日晨抽取空白血样后，立即空腹口服二巯丁二酸胶囊试验制剂或参比制剂500 mg，200 ml温开水送服，服药2 h后方能饮水，4 h后进食标准低脂肪、低蛋白早餐。于服药后0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、12.0、24.0 h取肘静脉血4 ml，立即移入肝素抗凝管中，分双份立即于-70℃贮存备测。

    1.5  样品预处理  取血液250 μl，加入80 μl 10 mg·ml-1 mBBr溶液(乙腈)，加入670 μl 0.1 mol·L-1 NH4HCO3(终体积1 ml，pH 8.2)，吹N2 15 s，封口，涡旋30 s，室温暗室中孵育30 min，加入1 ml 乙腈，涡旋1 min，23℃ 12 000 r·min-1，离心5 min，取上层液体，加入4 ml二氯甲烷，涡旋1 min，5 000 r·min-1，离心5 min，取上层水相，用3 mol·L-1HCl溶液调节pH至6～7，进样20 μl分析。

    1.6  统计学处理  根据所测二巯丁二酸血浓度-时间数据，利用《DAS 2.0》主要药代动力学参数(t1/2，AUC0-∞，AUC0-24)，Cmax和Tmax采用实测值。AUC为统计矩计算值。相对生物利用度按公式F=(AUC0-24)T/(AUC0-24)R×100%计算。对二巯丁二酸单剂给药参比制剂和试验制剂的主要药代动力学参数进行方差分析、双单侧t检验及90%置信区间分析，评价两制剂的生物等效性。

    2  结果

    2.1  方法学研究

    2.1.1  色谱条件  色谱柱：AichromBond?AQ C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：甲醇(10 mmol·L-1四丁基溴化铵，10 mmol·L-1乙酸钠)?水(10 mmol·L-1四丁基溴化铵，10 mmol·L-1 乙酸钠，乙酸调pH 4.1)(47.5∶52.5，V/V)；流速：1.0 ml·min-1；柱温：25℃；荧光检测器，Ex=356 nm，Em=450 nm；进样量20 μl。

    2.1.2  方法特异性  在本试验条件下，二巯丁二酸的色谱峰能完全分离，没有明显的内源性杂质峰干扰。二巯丁二酸的保留时间为10.5 min。见图1。

    2.1.3  线性关系考察  精确称取二巯丁二酸标准品0.010 41 g，用0.2 mol·L-1氢氧化钠溶液溶解并定容至10 ml，-20℃避光保存，作为储备液。空白血液加入二巯丁二酸储备液，使二巯丁二酸浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mg·L-1，按“1.5”项下处理并进样测定，得二巯丁二酸峰面积A。以A为纵坐标，以对应浓度(C)为横坐标绘制标准曲线。经最小二乘法线性回归，得回归方程为A=196543.84333C-9683.25862 ，r=0.99979。

    2.1.4  精密度和回收率  本试验条件下, 制备0.2、0.8、5.6 mg·L-1的3种二巯丁二酸标准浓度血液(n=5)，按前法进行回收率和日内、日间精密度的测定。结果见表1。表1  二巯丁二酸精密度试验

    2.2  药代动力学研究结果  20名健康受试者随机双周期交叉单剂量口服500 mg试验制剂和参比制剂，用HPLC-FR测得不同时间的二巯丁二酸浓度，并绘制血药浓度-时间曲线，见图2。主要药动学参数，见表2。试验制剂与参比制剂人体相对生物利用度F为(99.00±11.42)%。

    2.3  生物等效性评价  利用《DAS 2.0》对二巯丁二酸参比制剂和试验制剂主要药代动力学参数进行方差分析、双单侧t检验和(1?2α)置信区间分析，评价两制剂的生物等效性。结果表明, 试验制剂二巯丁二酸胶囊(T)和参比制剂二巯丁二酸胶囊(R)单剂口服双交叉两周期试验二巯丁二酸主要药动学参数药物间和周期间无显著性差异(P＞0.05)，但个体间存在差异(P＜0.05)。双单侧t检验和(1?2α)置信区间分析个体间、周期间和剂型间符合生物等效的假设。因此，2种二巯丁二酸制剂具有生物等效性。表2  参比制剂和试验试剂主要药动学参数

    3  讨论

    目前，报道了多种测定生物样品中二巯丁二酸的方法如高效液相色谱、气相色谱和毛细管电泳法测定血液、血浆和尿中的二巯丁二酸含量。应用N, O?bis?三甲基硅烷基-乙酰胺衍生化，可用火焰离子化检测器检测［1］，应用毛细管电泳法可直接进样测定尿液中的二巯丁二酸含量［2］，二巯丁二酸氧化生成的二硫化物及与含巯基的蛋白结合生成化合物可用硼氢化钠(NaBH4)还原后测定［3］，但以上诸方法中皆存在样品处理复杂，分析时间长的缺点。本试验在Mariorino［4］高效液相色谱荧光法的基础上进行了改进，对二巯丁二酸的血药浓度和药动学进行了研究。应用荧光试剂mBBr衍生化二巯丁二酸，生成衍生化物后用HPLC-荧光检测器检测，该方法血液取用量少、灵敏度高、操作简单、重现性好，可以满足二巯丁二酸人体生物利用度研究的要求。

    研究结果表明，受试者口服2种二巯丁二酸制剂后，两种制剂的吸收、分布过程基本相似，各药动学参数之间无显著性差异，说明试验制剂与参比制剂生物等效。经统计学处理后发现二巯丁二酸在人体内的吸收程度有较大的个体差异(P＜0.05)，临床应用时应注意个体化给药方案。

【文献】
  1 Knudsen JJ, Mcgown EL. Gas chromatographic analysis of urinary dimercaptosuccinic acid. J Chromatogr，1988, 424(2):231?241.

2 Zhu X, Lever SZ. Analysis of meso-2,3-dimercaptosuccinic acid in human urine by capillary electrophoresis using direct injection. Anal Bioanal Chem，2003, 377(4):666?669.

3 Maiorino RM, Weber GL, Aposhian HV. Determination and metabolism of dithiol chelating agents. III. Formation of oxidized metabolites of 2,3?dimercaptopropane?1?sulfonic acid in rabbit. Drug Metab Dispos，1988, 16(3):455?463.

4 Mariorino RM, Akins JM, Blaha K, et al．Determination and metabolism of dithiol chelating agents: X. In humans, meso?2,3?dimercaptosuccinic acid is bound to plasma proteins via mixed disulfide formation.J Pharmacol Exp Ther，1990, 254(2):570?577.