血脉通颗粒对家兔动脉粥样硬化形成的干预作用机理研究
摘 要:目的：探索血脉通颗粒对家兔颈动脉粥样硬化斑块形成的干预作用机理。方法:高脂饲料加空气干燥术形成家兔颈动脉粥样硬化模型，并给予血脉通颗粒3个月后，观察各组家兔血清循环内皮细胞（CEC）、血清基质金属蛋白酶(MMP1、MMP9)及金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP1)、血清内皮素（ET）、一氧化氮（NO）、血浆cGMP、血管紧张素（AngⅡ）及血液黏度、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的变化。结果：血脉通颗粒可降低造模家兔血清CEC、MMP1、MMP9、MDA及ET，升高TIMP1、cGMP、AngⅡ、SOD及NO水平，改善造模家兔血液流变学指标。结论：血脉通颗粒可通过干预高血脂对血管内皮细胞的损伤、抑制血清MMP1和MMP9活性、干预高脂饲料喂食所造成血浆cGMP和AngⅡ水平下降、抗氧化及改变血液流变学等多途径、多环节、多靶点地干预颈动脉斑块形成。
关键词：动脉粥样硬化；循环内皮细胞；基质蛋白酶；一氧化氮；cGMP ；血管紧张素；血脉通颗粒
动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是一种累及全身动脉血管的非炎症性、退行性和增生性病变，发病机理复杂，我院研制的“血脉通颗粒”以“益肾泄浊法”立意，临床应用于预防及治疗颈动脉粥样硬化，取得较好的疗效。本研究旨在探讨血脉通颗粒干预颈动脉粥样斑块形成的作用机制。
1 实验材料
1.1 药品与试剂
血脉通颗粒［每克颗粒相当于1.452g生药，成人日用量为43.52g（生药）/60kg］，由常州市中医提供，批号：040728；辛伐他汀片，由杭州默沙东制药有限公司提供，批号：04043；丙基硫氧嘧啶，由南京美好生物工程研究所提供，批号：040108；MMP1、MMP9、TIMP1测定试剂盒，购自晶美生物工程有限公司,美国Oriono Diagostica公司生产，批号：00404；AngⅡ测定试剂盒，解放军总医院科技开发中心放射免疫研究所提供，批号：040704。
1.2 实验动物
雄性新西兰兔，体重2～2.5 kg，实验动物合格证号：SCXK（苏）2002-0123，实验动物使用许可证：SCXK（苏）2002-0053。
1.3仪器
vitar-200全自动生化分析仪，荷兰威图公司提供；TGL・16G台式高速离心机，上海医用分析仪器厂生产；UN―754分光光度计，上海第三分析仪器厂生产；JA2003分析天平，上海天平仪器厂生产；AUP-2-35G-01实验室级专用超纯化水机，重庆颐洋实业有限公司提供；DKZ―2型电热恒温振荡水槽，上海精宏实验设备有限公司提供；LDZ5―2低速自动平衡离心机，北京医用离心机厂生产；芬兰产LRB-12752计数器。
1.4 试验条件及统计处理
家兔单笼饲养，自由饮水，室温18～25℃。
实验数据采用t检验统计。
2实验方法
2．1 高脂饲料配制方法
配方：将5%胆固醇、10%猪油、0.1%丙基硫氧嘧啶加入家兔标准饲料粉中，饲料粉经充分混合后由江苏省青龙山动物养殖场加工成颗粒饲料。
2．2颈动脉粥样硬化造模方法〔1〕
动物适应性喂养1周，耳缘静脉取血，分离血清，分别测定血清胆固醇(TC)、血清三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDLc)、高密度脂蛋白-胆固醇(HDLc)，作为造模前的正常值，按血清TC水平随机分为6组，每组10只。正常组给普通饲料，模型组给予高脂饲料，喂养高脂饲料的同时，在严格无菌条件下,动物经3%戊巴比妥钠30 mg/kg 静脉麻醉,颈部脱毛清洁消毒后,作颈正中切皮,于甲状软骨上方水平分离右侧颈总动脉,长约2.5 cm ,两端以动脉夹阻断血流。4.5号头皮针尽可能平行于血管纵轴方向穿刺阻断血管的两端,生理盐水冲洗置换出管腔内的血液后,接上已调节好流量为250 mL/min的气流,历时5 min造成内皮干燥,然后管腔内重新充满生理盐水,放开临时动脉夹恢复血流。湿润棉片轻轻压迫穿刺点3～5 min止血。缝合皮肤创口并包扎。
2．3 给药方法和剂量
正常对照组：喂普通颗粒兔饲料，同时给予等量蒸馏水；模型对照组：喂高脂饲料，同时给予等量蒸馏水；血脉通1组、2组、3组除与模型对照组相同外，分别给予血脉通颗粒2 g(生药)/kg、4 g(生药)/kg、8 g(生药)/kg；辛伐他汀组：给予辛伐他汀0.05 g/kg。
2．4指标检测方法
CEC检测按〔2〕方法进行;血清MMP1、MMP9、TIMP1 浓度水平测定采用定量夹心酶免疫分析技术;血浆AngⅡ含量的测定:腹主动脉取血2 mL迅速放入含50 μL酶抑制剂的预冷试管中轻轻摇匀,4 ℃1000 r/min 离心5 min 分离血浆,样品-20 ℃保存待测,测定方法采用均相竞争法,具体操作严格按试剂盒说明书进行。
3 实验结果
3．1血脉通颗粒对脂质代谢紊乱及动脉硬化家兔CEC的影响
家兔造模后第4周开始，血中CEC显著增多，与正常组相比，有非常显著性差异（P<0.01），表明内皮细胞严重受损。血脉通高剂量组在造模后第4周、8周、12周血中CEC均低于模型组，与模型组相比，有显著性差异（P<0.05或P<0.01）;血脉通中剂量组在造模后第4周和12周时血中CEC与模型组相比，有显著性差异（P<0.05），表明血脉通颗粒可干预高血脂对血管内皮细胞的损伤作用。结果见表1。表1血脉通颗粒对脂质代谢紊乱及动脉硬化家兔CEC的影响 注:与正常组相比▲▲P<0.01；与模型组比较* P<0.05，**P<0.01
3．2 血脉通颗粒对实验性脂质紊乱及动脉硬化家兔血清MMP1、MMP9及TIMP1水平的影响造模后12周，模型组MMP1和MMP9水平显著升高，而TIMP1水平显著降低，与正常组相比，均有显著性差异（P<0.05或P<0.01）。血脉通高剂量组家兔血清MMP1和MMP9水平均低于模型组，而TIMP1水平高于模型组，与模型组相比，均有显著性差异（P<0.05或P<0.01）;血脉通中剂量组家兔血清MMP9水平低于模型组，与模型组相比，有显著性差异（P<0.05）。表明血脉通颗粒有抑制实验性脂质紊乱及动脉硬化家兔血清MMP1和MMP9活性作用。结果见表2。表2 血脉通颗粒对实验性脂质紊乱及动脉硬化家兔血清MMP
3．3 血脉通颗粒对脂质代谢紊乱及动脉硬化家兔血浆cGMP、AngⅡ的影响造模第12周，模型组家兔血浆cGMP和AngⅡ水平低于正常组，与正常组相比，有显著性差异（P<0.05或P<0.01），表明高脂饲料喂食造成家兔血浆cGMP和AngⅡ水平下降。血脉通高剂量组家兔血浆cGMP和AngⅡ水平高于模型组，与模型组相比，有显著性差异（P<0.05）；血脉通中剂量组家兔血浆AngⅡ水平高于模型组，与模型组相比，有显著性差异（P<0.05）。表明血脉通颗粒可抑制高脂饲料喂养所造成的家兔血浆cGMP和AngⅡ水平下降的作用。结果见表3。表3血脉通颗粒对脂质代谢紊乱及动脉硬化家兔cGMP、AngⅡ的影响
3．4 血脉通颗粒对脂质代谢紊乱及动脉硬化家兔ET、NO的影响模型组家兔血清ET水平高于正常组，与正常组相比，具有显著性差异（P<0.05）。血脉通三个剂量组家兔血清ET水平均低于模型组，与模型组相比，均有显著性差异（P<0.05）。模型组家兔血清NO水平与正常组相比，无显著性差异，而血脉通高、中两个剂量组家兔血清NO水平高于模型组，与模型组相比，有显著性差异（P<0.05）。见表4。表4血脉通颗粒对脂质代谢紊乱及动脉硬化家兔ET、NO的影响
3．5 血脉通颗粒对脂质代谢紊乱及动脉硬化家兔血液流变学的影响模型组家兔全血黏度高于正常组，与正常组相比，有显著性差异，表明高脂饮食已造成家兔血液黏度的增高。血脉通高、中、低剂量给药均能降低高脂家兔血浆全血比黏度，表明血脉通颗粒具有一定的改善血液流变学作用。见表5。表5血脉通颗粒对实验性脂质紊乱及动脉硬化家兔血液流变学的影响
3．6 血脉通颗粒对脂质代谢紊乱及动脉硬化家兔SOD、MDA的影响
模型组家兔血清SOD水平显著低于正常组，而MDA含量高于正常组，与正常组相比，均有显著性差异，表明高脂饮食喂养造成家兔体内SOD活力下降，过氧化物沉积。血脉通高剂量组家兔血清SOD高于模型组，MDA含量低于模型组，与模型组相比，有显著性差异，表明血脉通颗粒具有一定的抗氧化和清除过氧化物的作用。见表6。表6血脉通颗粒对脂质代谢紊乱及动脉硬化家兔SOD、MDA的影响
4 讨论
本研究通过高脂饲料加空气干燥术方法制造家兔颈动脉粥样硬化模型，在造模的同时给予相应药物以干预动脉斑块形成。实验结果显示，模型组家兔颈动脉、主动脉及冠状动脉均有明显的斑块生成，血脂代谢紊乱，血液流变学异常，血中循环内皮细胞显著增多，血清基质金属蛋白酶MMP1、MMP9显著升高，超氧化物歧化酶活力下降，过氧化物含量增高，表明高脂饲料加空气干燥术不但造成了家兔动脉粥样硬化，还使家兔血脂代谢紊乱，内皮细胞损伤及血液黏度异常。
动脉粥样硬化是一种以细胞增生和脂质代谢异常为主要病变的疾病，其中内皮细胞受损是导致AS形成的始动环节。本研究结果显示家兔在造模1个月后，血中循环内皮细胞即明显增高，且在造模3个月一直高于正常对照组，表明高脂饮食加空气干燥术方法首先造成内皮细胞损伤。血脉通颗粒在造模1个月时，血中循环内皮细胞就显著低于模型组，表明血脉通颗粒具有稳定内皮细胞的作用。ET是一种很强的促有丝分裂物质，可促进血管平滑肌细胞增殖。有人发现〔3〕动脉粥样硬化患者硬化斑块中的巨噬细胞和平滑肌细胞中含有较多的ET免疫活性物质，实验室研究也发现，在动脉粥样硬化组织内，不仅有ET的过度合成和释放，而且粥样斑块上的ET受体的数目可增加一倍，呈明显的受体上调，在增生的血管平滑肌细胞中，ET生成活跃，管壁内滋养动脉对ET敏感性异常增高，表现为ET持久的缩血管作用，可导致并加重血管内膜的损伤，引起AS病变的。血脉通颗粒能明显降低实验动物血浆ET，也提示其具有保护血管内膜的作用。而内皮衍生舒张因子（EDRF）的本质为NO，近年的研究证实〔4〕NO是一种血管平滑肌增殖的抑制性调节物，在高血脂等因素影响下，氧化低密度脂蛋白损伤血管内皮细胞，影响其分泌功能，导致内皮型NO的分泌减少，从而导致血管舒张功能障碍，血管痉挛，成为AS发生的重要机制之一。另外，NO还有抑制血管平滑肌增殖以及抗氧化损伤作用，本项实验表明血脉通颗粒能升高家兔血浆NO，提示这也是血脉通颗粒干预动脉粥样硬化的途径之一。血脉通颗粒还能降低实验性脂质代谢紊乱家兔的血液高黏状态。血流通畅，不利的血流动力学因素降低，有助于减少血管内皮的损伤，从而保护血管内膜。在血管组织中,血管平滑肌细胞既合成血管基质的主要成分――Ⅳ型胶原，又合成和分泌对Ⅳ型胶原进行降解的MMP1和MMP9。近年证实, MMP1和MMP9在血管平滑肌细胞迁移和增殖及血管再狭窄发生过程中起重要作用。本研究结果显示，在造模12周后，模型组家兔血清MMP1和MMP9显著升高，而血脉通颗粒高剂量组家兔血清MMP1和MMP9水平均低于模型组，而TIMP1水平高于模型组，表明血脉通颗粒有抑制实验性脂质紊乱及动脉硬化家兔血清MMP1和MMP9活性的作用。
血脉通颗粒以益肾泄浊法立意，由何首乌、淫羊藿、黄芪等中药组成，具有益肾泄浊之功效。方中淫羊藿能补肾助阳，强健筋骨，为君药；何首乌生用重在润肠、解毒作用，为臣药；黄芪补气升阳、利水退肿，该方疏养并调、体用并治，相辅相成从而达到调节血脂、防治动脉粥样硬化之效。于永红等〔5-6〕研究表明，淫羊藿具有促进主动脉AS病灶和冠状动脉AS病灶消退及抑制的癌基因Cmyc、Cfos、Vsis表达作用，体外实验结果显示淫羊藿尚具有抑制血管平滑肌增殖作用。药理研究表明：何首乌对实验性家兔血清胆固醇升高有抑制作用，并能减少家兔肠道胆固醇的吸收，能缓解动脉粥样硬化的形成，阻止类脂质在血清滞留或渗透到动脉内膜；黄芪所含总黄酮能清除多种自由基〔7〕、明显降低血浆胆固醇浓度和主动脉壁中胆固醇的沉积〔8〕。本研究显示血脉通颗粒具有良好的干预颈动脉、主动脉及冠状动脉斑块形成作用，其可能通过干预高血脂对血管内皮细胞的损伤，抑制血清MMP1和MMP9活性和干预高脂饲料喂养所造成血浆cGMP和AngⅡ水平下降的作用，抗氧化及改变血液流变学等多途径、多环节、多靶点干预颈动脉斑块形成。
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〔1〕张磊,陈国荣,郑荣远,等.高脂饲料加空气干燥术建立兔颈动脉粥样硬化模型[J].动脉硬化杂志,2001,9(2):155-158.
〔2〕陶波，李晓宁.蒲黄对动脉粥样硬化血管内皮细胞损伤影响的实验研究[J].中西医结合心脑血管杂志，2004,2(4):222-223.
〔3〕汤健,魏英杰.心血管活性物质与心血管疾病[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997：242.
〔4〕Berdeaux A.Nitrics oxide：An ubiquitous messenger[J].Foundam Clin Pharmacol, 1993，7(5):401-411.
〔5〕于永红，孟卫星，张国安，等.茵陈、赤芍、三棱、淫羊藿对家兔实验性动脉粥样硬化病灶的消退作用及原癌基因Cmyc、Cfos、Vsis表达的影响[J]. 湖北民族学院学报（医学版）,2001，18（2）：4-7.
〔6〕于永红，胡昌兴，孟卫星，等.茵陈、赤芍、三棱、淫羊藿对体外培养的兔动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用[J].湖北民族学院学报（医学版）,1999，16（2）：1-3.
〔7〕汪德清，沈文梅,田亚平，等.黄芪三种提取成分对氧自由基作用的影响[J].中国药通报,1994,10(2):129-132.
〔8〕汪德情，丁保国，Tomas G Neil，等.黄芪总黄酮对动脉粥样硬化早期形成的影响[J].中国药理学通报,2003,19(6):637-638.
