枸杞多糖对地塞米松诱导的小鼠脾脏细胞凋亡的影响

【摘要】  目的 探讨枸杞多糖（LBP）对地塞米松（DEX）诱导的小鼠脾脏细胞凋亡的影响。方法 以水提取-乙醇沉淀法制备LBP，分别给予实验小鼠每天口服LBP 25、50、100 mg,10 d后体外实验取小鼠脾脏细胞与10-5、10-6、10-7 mol／L的DEX共同孵育，6 h后检测细胞凋亡率；体内实验给予小鼠腹腔注射DEX（25 mg/kg），10 h后取脾脏细胞直接检测凋亡率。结果 实验动物预先口服LPB 10 d后，可使DEX诱导的小鼠脾脏细胞凋亡率显著降低，并呈现量效关系。结论 LPB的免疫调节和促进作用与其对免疫细胞的保护、降低免疫细胞凋亡有关。

【关键词】  枸杞多糖; 脾脏细胞; 凋亡; 小鼠

　　Abstract:Objective To study the effect of polysaccharide from lycium barbarum (LBP) on spleen cell apoptosis induced with dexamethasone in mice. Methods The Kunming mice were orally administrated with 25, 50, and 100 mg LPB everyday respectively for 10 days. Then the mice were divided into two groups (A groups for in vivo experiment and B groups for in vitro experiment). Spleen cells which was separated from mice in group A was incubated with dexamethasone at the doses of 10-5, 10-6, and 10-7mol／L for 6 hours, then the rates of apoptosis were detected. 10 hours after intraperitoneal injection of dexamethasone at the dose of 25 mg/kg in mice in group B, spleen cells were separated and the rates of apoptosis were detected immediately. Results Oral administration with LBP for 10 days could significantly lower the apoptosis rates of spleen cells of mice induced with dexamethasone with dose?dependent effects. Conclusion The up?regulation of LBP on immuno?function is related to its effects of low cell apoptosis.

　　Key words:lycium barbarum; polysaccharide;spleen cell;  apoptosis

　　细胞凋亡(apoptosis)又称程序性细胞死亡，是细胞生理性死亡的主要形式，在控制细胞增殖和分化、肿瘤的发生和生长等方面都起着重要的作用，也是机体免疫衰老过程中重要的分子机制之一。可以诱发细胞发生凋亡的因素很多，本研究以地塞米松与小鼠脾脏细胞共同孵育，诱发脾脏细胞凋亡为模型，探讨枸杞多糖（lycium  barbarium palysacharides, LBP）在体外和体内对大鼠脾脏细胞凋亡的影响，现报道如下。
   
　　1材料与方法

　　1.1材料与主要试剂 
    　　
　　枸杞多糖（LBP）：宁夏枸杞，购自广州市药材公司，乙醇回流提取，LBP含量为48.6%,冷冻干燥备用。
    　　
　　24孔平底细胞培养板：德国Greiner公司。
    　　
　　实验动物：健康成年昆明种小鼠,体质量18～22 g，由中山大学实验动物中心提供，雌雄兼用,合格证号99A057。

　　1.2方法

　　1.2.1实验分组适应性喂养5 d后将小鼠分为两组：A正常对照组：普通饲料喂养，每天胃饲生理盐水0.2 mL；B 枸杞多糖组：饲料同上，每天胃饲不同浓度的枸杞多糖0.2 mL，枸杞多糖含量分别为25、50、100 mg。连续喂养10 d后分再分体外实验和体内实验两部分进行。体外实验：脱颈椎处死小鼠，无菌操作取出脾脏，按常规制成脾脏细胞悬液，台盼蓝检查细胞活性，计数并调整细胞至1×107／mL，加入地塞米松并使其终浓度分别为10-5、10-6、10-7 mol／L。每组均做双份，另设空白对照（不加DEX）。各取2 mL细胞悬液置细胞培养孔，5％CO2、37 ℃孵育6 h后，分别作形态学观察和流式细胞术检测细胞凋亡情况。体内实验 ：于小鼠腹腔注射地塞米松（25 mg/kg），10 h后取出小鼠脾脏，分离细胞并制成细胞悬液，直接进行检测。

　　1.2.2形态学观察按常规方法，4％甲醛室温下固定细胞10 min，取一滴涂于预先用2％(V∶V)氨丙基三乙氧基硅烷(APES，Sigma公司)丙酮液处理的载玻片上，晾干后用苏木精伊红染色。

　　1.2.3流式细胞术分析取已培养6 h样本，按1∶3与70％乙醇混匀，置4 ℃过夜后用吖啶橙(AO)染色，流式细胞仪(美国Coulter公司)检测细胞变性DNA比例，机载软件处理后得出细胞凋亡率，每份样品检测细胞数>104。

　　1.2.4统计学处理实验数据用±s表示，两组均数间比较用t检验，以P＜0.05为差异有显著性。

　　2结 果

　　2.1地塞米松对离体小鼠脾脏细胞的凋亡诱导作用 
   
　　体外实验中，与小鼠脾脏细胞共同孵育6 h后，10-5、10-6、10-7mol／L 的地塞米松均有诱发小鼠脾脏细胞脾脏细胞凋亡的作用，促进其DNA片段化，表现出明显的凋亡细胞特征。体内实验中，小鼠腹腔注射地塞米松（25 mg/kg）10 h后,表现出明显地诱发小鼠脾脏细胞脾脏细胞凋亡的作用，差异具有极显著性(P＜0.01)。见表1。

　　表1DEX对小鼠脾脏细胞的凋亡诱导作用 　略

　　2.2枸杞多糖对地塞米松诱导小鼠脾脏细胞凋亡的影响 
   
　　将胃饲不同含量枸杞多糖10 d的小鼠脾脏细胞悬液，加入10-6mol／L地塞米松孵育6 h后，观察枸杞多糖对小鼠脾脏细胞凋亡的影响，结果表明，25 mg／d枸杞多糖即可去除地塞米松在体外对小鼠脾脏细胞凋亡的诱导作用，实验组与对照组比较，差异具有极显著性。 随着LPB浓度的增加，实验动物脾脏细胞的凋亡率进一步下降；对胃饲不同含量枸杞多糖10 d的小鼠腹腔注射地塞米松（25 mg/kg）,10 h后观察枸杞多糖对小鼠脾脏细胞凋亡的调节作用，结果如表2所示，胃饲100 mg／d枸杞多糖10 d后,能显著降低地塞米松对小鼠脾脏细胞凋亡的诱导作用（P＜0.05）。

　　表2LPB对DEX诱导小鼠脾脏细胞凋亡的影响　略

　　3讨 论
    　　
　　细胞凋亡是体内细胞的一种生理性调节机制，它与有丝分裂功能相反，是调节细胞群体减少。细胞凋亡不仅在胚胎发生、器官发育及保持机体自稳状等过程中至关重要，而且在控制细胞增殖和分化、肿瘤的发生和生长以及在机体的免疫调节中有重要作用，因此对细胞凋亡的研究引起了人们极大的兴趣，并不断向基因水平深入［1，2］。 迄今已证实许多因素都可诱导细胞发生凋亡，本研究结果进一步证实，无论是腹腔注射或在体外与细胞共同孵育，地塞米松都可以诱导小鼠脾脏细胞出现显著的凋亡现象，提示糖皮质激素对机体免疫细胞具有明显的抑制作用。
    　　
　　枸杞为传统中药之一，研究表明枸杞中含有多种营养成分和微量元素，其主要有效成分为枸杞多糖。枸杞多糖具有广泛的生物学作用，包括促进和调节机体免疫功能、抗肿瘤、抗辐射［3，4］等。表明，枸杞多糖对实验动物的胰岛细胞、肝脏细胞、肾脏细胞和心肌细胞等多种细胞有保护作用［5］。

　　枸杞提取物在体外与实验动物细胞共同孵育时，能解除糖皮质激素对免疫细胞的凋亡诱导作用［6］。本研究采用地塞米松诱导小鼠脾脏细胞凋亡为模型，证明了在预先给予实验动物口服枸杞多糖25、50、100 mg 10 d后，其脾脏细胞对体外与地塞米松共同孵育时所诱导产生的凋亡率明显降低（P＜0.01）；将地塞米松给药方式改为腹腔注射（25 mg/kg）时，预先口服枸杞多糖100 mg 10 d后，能解除地塞米松对实验动物脾脏细胞的凋亡诱导作用，使细胞凋亡率明显降低（P＜0.05）。枸杞多糖在体内和体外对地塞米松诱导脾脏细胞的凋亡，均有明显的解除作用，提示枸杞多糖对脾脏细胞具有强大的保护作用。枸杞多糖对机体免疫细胞的保护作用，与其免疫促进和免疫调节作用有密切关系，但其机理目前尚不清楚，有待进一步研究。  

【文献】
  　　［1］ 蔡宇，余绍蕾，张荣华. 枸杞多糖对染铅小鼠行为功能保护及脑细胞Fas抗原表达的影响［J］.环境与职业医学,2005,22(6):533.

　　［2］ 李德远,汤坚,徐现波,等.枸杞多糖对慢性辐射小鼠细胞凋亡及Bcl-2基因表达的影响 ［J］.营养学报,2005,27(3)：235.

　　［3］ 刘彦平，李积东. 枸杞多糖对小鼠NK细胞和白细胞活性的免疫调节作用［J］.青海医学院学报,2001,22(1):1.

　　［4］ 徐曼艳,王煜飞,张红峰,等.枸杞多糖对四氧嘧啶损伤离体大鼠胰岛细胞的作用［J］.河北中医,2002,24(8):636.

　　［5］ 杨建军,胡淑婷,张 淼,等．枸杞多糖对排演心肌细胞自由基损伤的超微结构的影响 ［J］.中医基础医学杂志,2001,7(1):37.

　　［6］ 吕小迅，洗雪芬，吕伟标，等， 枸杞对大鼠脾脏细胞凋亡的影响 ［J］ .中药材,1999,22(5)：250.