祛湿化瘀方对非酒精性脂肪性肝炎大鼠组织蛋白酶B和肿瘤坏死因子α表达的影响

【摘要】  研究祛湿化瘀方防治大鼠非酒精性脂肪肝的作用机制。 方法：除正常对照组5只外，Wistar雄性大鼠30只运用四氯化碳（carbon tetrachloride, CCl4）皮下注射联合高脂低蛋白饮食建立非酒精性脂肪肝模型。自造模2周后，随机分为模型组、祛湿化瘀方组和甘乐(复方二氯醋酸二异丙胺)组，每组10只，分别予祛湿化瘀方和甘乐10 ml/kg灌胃。用药2周后取材，检测血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）活性和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor?α, TNF?α）含量、肝组织甘油三酯（triglyceride, TG）和游离脂肪酸（free fatty acid, FFA）含量；并分析其指标间的相关性。蛋白印迹法检测肝组织组织蛋白酶B（cathepsin B, Ctsb）、磷酸化κB抑制蛋白（phospho?inhibitor kappa B, P?IκB）和TNF?α蛋白表达。免疫组织化学染色检测肝组织中Ctsb表达。 结果：祛湿化瘀方可显著降低模型大鼠肝组织TG（P<0.05）、FFA（P<0.01）含量和血清ALT活性（P<0.05），而对照药物甘乐只显示有降低ALT活性（P<0.05）作用；模型组肝组织Ctsb、P?IκB、TNF?α蛋白表达均高于正常对照组，同时血清TNF?α水平显著上升；而祛湿化瘀方组的上述蛋白表达则低于模型组。肝组织TG与FFA含量、血清ALT活性呈正相关；血清TNF?α与肝组织FFA含量、血清ALT活性呈正相关。结论：祛湿化瘀方抑制肝脏脂肪沉积和炎症作用可能与其抑制FFA以减轻其下游“FFA?Ctsb?TNF?α”肝脂毒性通路有关。

【关键词】  非酒精性脂肪肝 祛湿化瘀方 游离脂肪酸 瘤坏死因子 织蛋白酶B 大鼠

    Methods: Thirty?five Wistar male rats were randomly divided into normal group, untreated group, QHD group and Ganle (diisopropylamine dichloroacetate) group. The rats except those in normal group were subcutaneously injected with carbon tetrachloride (CCl4) for 4 weeks (twice per week) and simultaneously fed with high?fat and low?protein diet for 2 weeks to induce NASH. Then, the rats were administrated with QHD, Ganle, or distilled water for 2 weeks, respectively. After harvest, alanine aminotransferase (ALT) activity and tumor necrosis factor?α (TNF?α) content in serum as well as triglyceride (TG) and free fatty acid (FFA) in liver tissue were evaluated, and relativity analysis among these parameters was performed. Cathepsin B (Ctsb), phospho?inhibitor kappa B (P?IκB), TNF?α protein expressions in liver tissue were assayed with western?blot. The expression and distribution of ctsb in liver tissue were observed with immunohistochemical method.

    Results: The contents of TG, FFA and activity of ALT were significantly decreased in QHD group. While in the Ganle group, only the activity of ALT in serum was decreased significantly. Expressions of Ctsb, P?IκB and TNF?α proteins in liver tissues and serum TNF?α level were all enhanced in untreated group which, however, were significantly inhibited in the QHD group. And as expected, there were significant relativities among contents of TG in liver tissues and the content of FFA in liver tissue and activity of ALT in serum, content of TNF?α in serum and content of FFA in liver tissue and activity of ALT in serum.

    Conclusion: The inhibiting effects of QHD on fat deposition and inflammation in liver are related with its inhibition on the "FFA?Ctsb?TNF?α" pathway of lipo?toxicity.

    Keywords: non?alcoholic fatty liver disease; Qushi Huayu Decoction; free fatty acid; tumor necrosis factor?α; cathepsin B; rats

    我们前期实验发现祛湿化瘀方（Qushi Huayu Decoction, QHD）对四氯化碳（carbon tetrachloride, CCl4）联合高脂低蛋白饮食诱导的大鼠脂肪肝有显著的防治作用［1］，能显著降低大鼠肝组织甘油三酯（triglyceride, TG）和游离脂肪酸（free fatty acid, FFA）含量，减轻肝损伤。FFA可以通过肝细胞溶酶体途径，促使组织蛋白酶B（cathepsin B, Ctsb）释放到胞浆，刺激肿瘤坏死因子?α（tumor necrosis factor?α, TNF?α）的表达，造成肝脏脂毒性肝损伤［2］。我们推测该方可能对“FFA?Ctsb?TNF?α”通路有重要影响，并初步经体外实验证实［3］。为此，本实验运用CCl4复合高脂低蛋白饮食诱导的大鼠非酒精性脂肪性肝炎（non?alcoholic steatohepatitis, NASH）动物模型，观察Ctsb和TNF?α的变化及祛湿化瘀方的干预作用，进一步探讨其作用机制。

    1  材料和方法

    1.1  实验材料

    1.1.1  实验动物  Wistar雄性大鼠35只，体质量（170±10）g，SPF级，购自院上海实验动物中心。动物合格证号为SCXK（沪）2003?0003。

    1.1.2  药物和试剂  祛湿化瘀方由虎杖、姜黄、茵陈、田基黄和栀子5味中药组成。采取乙醇提取和水提合煎的提取工艺，配制成含生药1.16 g/ml的祛湿化瘀方药液，由上海中医药大学科技中心协助制备。复方二氯醋酸二异丙胺片，商品名为甘乐，2 mg/片，批号H21023819，购自辽宁丹东制药厂，将片剂碾成粉末状，按2 mg甘乐︰1 ml蒸馏水，配成浓度为2 mg/ml的悬浊液。CCl4和橄榄油均购自中国医药集团上海化学试剂公司，用时配成40% CCl4橄榄油溶液；血清丙氨酸转移酶（alanine aminotransferase, ALT）、TG和FFA试剂盒均购自南京建成生物制品研究所；大鼠血清TNF?α酶联免疫吸附检测试剂盒和多克隆羊抗大鼠TNF?α一抗，购自R＆D公司；单克隆小鼠抗大鼠磷酸化κB抑制蛋白（phospho?inhibitor kappa B, P?IκB）一抗、多克隆兔抗大鼠Ctsb一抗均为Cell Signaling Technology公司产品；单克隆小鼠抗大鼠甘油醛?3?磷酸脱氢酶（glyceraldehyde?3?phosphate dehydrogenase, GAPDH）一抗，为康成生物科技公司产品；多克隆兔抗羊二抗，为Jackson Immunoresearch Laboratories公司产品；羊抗兔IgG多克隆二抗、兔抗小鼠单克隆二抗，均为Santa Cruz Biotechnology公司产品。

    1.2  实验方法

    1.2.1  模型选择和制备方法  CCl4联合高脂低蛋白饮食因素诱导的大鼠脂肪肝模型［1］：首次用100% CCl4 5 ml/kg体质量在大鼠背部作皮下注射，后以40% CCl4?橄榄油溶液按3 ml/kg体质量在大鼠背部作皮下注射，每周2次，共4周。造模的第1和第2周饲以高脂低蛋白玉米粉饲料（79.5%玉米粉+20%猪油+0.5%胆固醇），第3和第4周以纯玉米粉饲养。

    1.2.2  动物分组与用药  除正常对照组外（n=5），造模2周后将30只大鼠随机分为模型组、甘乐组和祛湿化瘀方组，每组10只。组大鼠分别予祛湿化瘀方和甘乐10 ml/kg灌胃，1/d，共2周。正常对照组和模型组大鼠予等量生理盐水灌胃。祛湿化瘀方组和甘乐组大鼠在实验过程中因意外因素各死亡1只。

    1.2.3  观察指标及方法  治疗2周后，下腔静脉采血，并取肝组织。（1）血清ALT活性测定：按生化试剂盒说明书进行检测。（2）肝组织TG含量检测：取200 mg湿肝，加入乙醇?丙酮（1︰1）液3 ml，制备肝组织匀浆液，用TG试剂盒检测，以每克肝组织含多少毫克TG来表示。（3）FFA含量检测：取100 mg湿肝，加0.9 ml生理盐水，制备10%肝组织匀浆液，按试剂盒步骤检测。（4）酶联免疫吸附法检测血清TNF?α含量：用酶联免疫吸附试剂盒检测正常对照组、模型组和祛湿化瘀方组大鼠血清TNF?α含量，按试剂盒说明书进行。（5）蛋白印迹法检测肝组织中TNF?α、P?IκB和Ctsb蛋白表达：半定量分析运用机图像分析系统光密度扫描，求出蛋白表达的灰度值。将目的蛋白灰度值除以内参照灰度值，并以正常组为单位1，作柱状图。（6）免疫组织化学染色检测肝组织Ctsb表达：石蜡切片进行脱蜡至水，胰蛋白酶消化，小牛血清白蛋白封闭，然后分别滴加一抗、二抗及显色液。其中，阴性对照组是指正常组不滴加Ctsb一抗，用PBS代替。

    1.3  统计学方法  所有数据使用SPSS 11.0软件包进行统计学分析。相关性分析采用Bivariate相关分析。多组间比较用方差分析，组间比较用多重检验。计量资料数据用x±s表示。

    2  结  果

    2.1  各组大鼠血清ALT活性和TNF?α含量  模型组大鼠血清ALT活性高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。祛湿化瘀方及甘乐均能降低模型大鼠血清ALT活性（P<0.01），其抑制率分别达67.7%和66.1%。模型组大鼠血清TNF?α含量高于正常对照组（P<0.05），而祛湿化瘀方组大鼠血清TNF?α含量低于模型组（P<0.05），其抑制率达75.8%。见表1。

    2.2  各组大鼠肝组织TG和FFA含量  模型组大鼠肝组织TG和FFA含量高于正常组（P<0.01），分别达正常对照组的5.3倍和1.9倍。祛湿化瘀方组大鼠肝组织的TG含量低于模型组（P<0.05），其抑制率为25.8%。甘乐组大鼠肝组织TG含量较模型组有下降趋势，但差异无统计学意义。祛湿化瘀方组大鼠肝组织中FFA含量低于模型组和甘乐组（P<0.01），抑制率高达82.7%，并低于甘乐组（P<0.01）。甘乐组和模型组比较，差异无统计学意义。见表1。表1  大鼠血清ALT活性和TNF?α含量及肝组织TG、FFA含量

    2.3  肝损伤指标和肝脂肪含量相关性分析  相关性分析结果表明，肝组织TG与FFA含量（y=0.0382x＋10.15, r=0.628, P<0.01）、血清TNF?α与肝组织FFA含量（y=0.0063x＋10.321, r=0.577, P<0.05）存在正相关，血清ALT活性与肝组织TG含量（y=0.2796x＋31.73, r=0.504, P<0.01）、血清ALT与TNF?α（y=5.8931x－11.567, r=0.528, P<0.05）之间呈显著正相关。见图1。

    2.4  各组大鼠肝组织TNF?α、Ctsb蛋白表达及IκB磷酸化水平的变化  正常组大鼠肝组织少量表达TNF?α、Ctsb蛋白，几乎检测不到IκB磷酸化，而模型组肝组织TNF?α、Ctsb蛋白表达及IκB磷酸化水平均显著增加，祛湿化瘀方组TNF?α、Ctsb蛋白表达及IκB磷酸化水平低于模型组。见图2、3和4。

    2.5  各组大鼠肝组织Ctsb免疫组织化学染色变化  正常大鼠肝脏中，Ctsb棕色颗粒呈点状分布(和溶酶体定位一致)，正常组（阴性对照）无Ctsb表达。模型组Ctsb蛋白表达显著增加，胞浆中可见大量的棕色颗粒，而祛湿化瘀方组Ctsb表达明显减少。见图5。

    3  讨  论

    本实验结果提示，祛湿化瘀方有抗肝脏炎症和降低肝脏脂质的作用。该方能明显降低模型大鼠肝组织中FFA、TG含量和血清ALT活性、TNF?α含量。我们对上述指标进行相关性分析，肝组织TG与FFA含量、血清ALT活性呈正相关；血清TNF?α与肝组织FFA含量、血清ALT活性呈正相关。提示其脂肪沉积含量与肝损伤程度密切相关。

    那么，FFA是通过什么途径引起TNF?α表达，导致肝损伤的呢？Feldstein等［2］研究发现，FFA可以通过肝细胞溶酶体途径刺激TNF?α表达，造成肝脏脂毒性。经FFA刺激后，首先Bax向溶酶体内转位，促使Ctsb释放到胞浆，激活I?κB激酶β（IKK?β）使I?κB磷酸化降解，导致NF?κB的活化，使之向细胞核内移位，启动炎症因子如TNF?α的基因转录，大量表达引起TG的蓄积，发生脂肪变性；TNF?α又能进一步促进溶酶体渗透，激活NF?κB，这样形成一个加重肝损伤的循环即“FFA?Ctsb?TNF?α”通路。因此，我们鉴于本实验中“FFA?TNF?α（肝损伤）”存在显著正相关，进一步观察Ctsb的变化以及该方对Ctsb环节的影响。

    本实验通过蛋白印迹检测发现模型组大鼠肝组织Ctsb表达增加，而祛湿化瘀方明显降低了Ctsb的表达。同时免疫组织化学染色结果表明模型组胞浆中可见大量的Ctsb棕色颗粒，而祛湿化瘀方组Ctsb表达明显减少。Ctsb是溶酶体内一种半胱氨酸蛋白酶，参与多种疾病的病理过程［4, 5］。Werneburg等［6］在研究中发现，Ctsb在TNF?α诱导的肝脏损伤中发挥着重要的作用，TNF?α通过caspase?8和Bid介导可引起溶酶体释放Ctsb。Guicciardi等［7］敲除小鼠Ctsb基因后，发现能够对抗TNF?α相关的肝细胞凋亡，其作用机制在于抑制线粒体释放细胞色素C和caspase活化；另有报道提示抑制Ctsb活性可以部分减轻TNF?α引起的肝损伤［8］。本实验结果表明祛湿化瘀方可通过抑制FFA以减轻其下游Ctsb的表达。

    那么，该方是否抑制了NF?κB的活化？NF?κB是细胞中普遍存在的一种介导细胞内信号传递的转录因子，在炎症反应的复杂细胞因子中，NF?κB的激活可能是一中心环节［9］。当细胞处于静息状态时，NF?κB与其抑制蛋白IκB结合，以三聚体失活状态存在于细胞质中，当机体受到外界因素刺激时，IκB发生磷酸化，并从NF?κB二聚体上解离，暴露p50的核定位信号，NF?κB得以激活并移位进入细胞核，结合免疫炎症相关靶基因上特异的κB结合位点，启动炎症因子如TNF?α的基因转录，导致炎症反应和肝损伤［10,11］。本研究Western blot检测表明，祛湿化瘀方能抑制P?IκB蛋白表达，从而抑制了NF?κB的活化，通过NF?κB/IκB信号转导途径抑制TNF?α蛋白表达、阻断TNF?α的生物活性和靶效应。

    由此可见，祛湿化瘀方抑制肝脏脂肪沉积和炎症的作用机制之一在于抑制了“FFA?Ctsb?TNF?α”肝脂毒性信号通路。该方可通过抑制FFA以减少其下游Ctsb的表达进而抑制NF?κB的活化和TNF?α的表达，从而减轻肝损伤。

【】
  1 Zhang H, Feng Q, Hu YY, et al. Prevention and treatment of "Qushi Huayu Decoction" on fatty liver of rats induced by carbon tetrachloride along with high?fat and low?protein diet. Shanghai Zhong Yi Yao Za Zhi. 2006; 40(3): 52?55. Chinese with abstract in English.

张慧, 冯琴, 胡义扬, 等. 祛湿化瘀方对CCl4复合高脂低蛋白饮食诱导的大鼠脂肪肝的防治作用. 上海中医药杂志. 2006; 40(3): 52?55.

2 Feldstein AE, Werneburg NW, Canbay A, et al. Free fatty acids promote hepatic lipotoxicity by stimulating TNF?alpha expression via a lysosomal pathway. Hepatology. 2004; 40(1): 185?194.

3 Zhang H, Hu YY, Feng Q, et al. Inhibitory effects of Qushi Huayu Decoction on fatty deposition and tumor necrosis factor α secretion in HepG2 cells induced by free fatty acid. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 2007; 27(12): 1105?1109. Chinese with abstract in English.

张慧, 胡义扬, 冯琴, 等. 祛湿化瘀方对游离脂肪酸诱导的HepG2细胞脂肪沉积和TNF?α分泌的抑制作用. 中西医结合杂志. 2007; 27(12): 1105?1109.

4 Im E, Venkatakrishnan A, Kazlauskas A. Cathepsin B regulates the intrinsic angiogenic threshold of endothelial cells. Mol Biol Cell. 2005; 16(8): 3488?3500.

5 Vasiljeva O, Papazoglou A, Krüger A, et al. Tumor cell?derived and macrophage?derived cathepsin B promotes progression and lung metastasis of mammary cancer. Cancer Res. 2006; 66(10): 5242?5250.

6 Werneburg N, Guicciardi ME, Yin XM, et al. TNF?alpha?mediated lysosomal permeabilization is FAN and caspase 8/Bid dependent. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2004; 287(2): 436?443.

7 Guicciardi ME, Miyoshi H, Bronk SF, et al. Cathepsin B knockout mice are resistant to tumor necrosis factor?alpha?mediated hepatocyte apoptosis and liver injury: implications for therapeutic applications. Am J Pathol. 2001; 159(6): 2045?2054.

8 Foghsgaard L, Wissing D, Mauch D, et al. Cathepsin B acts as a dominant execution protease in tumor cell apoptosis induced by tumor necrosis factor. J Cell Biol. 2001; 153(5): 999?1010.

9 Thanos D, Maniatis T. NF?kappa B: a lesson in family values. Cell. 1995; 80(4): 529?532.

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