祛风通络方对大鼠系膜细胞增殖及转化生长因子β1和白细胞介素6 mRNA表达的影响

【摘要】  观察祛风通络方对脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的大鼠肾小球系膜细胞（mesangial cell, MC）增殖及其分泌的转化生长因子β1（transforming growth factor?beta1, TGF?β1）和白细胞介素6（interleukin?6, IL?6） mRNA表达的影响。方法：采用血清药方法，体外培养大鼠肾小球系膜细胞，分为正常对照组、模型组、蒙诺（福辛普利钠）组和祛风通络方组。并采用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）法检测大鼠MC增殖情况，逆转录聚合酶链反应法检测TGF?β1和IL?6 mRNA的表达。 结果：与正常对照组比较，模型组大鼠肾小球系膜细胞增殖升高（P<0.05）；与模型组比较，祛风通络方组大鼠肾小球系膜细胞增殖受到抑制（P<0.05），且祛风通络方作用优于蒙诺（P<0.05）。模型组系膜细胞TGF?β1 mRNA表达高于正常对照组（P<0.01）；祛风通络方组和蒙诺组系膜细胞TGF?β1 mRNA表达低于模型组（P<0.01）；祛风通络方组与蒙诺组比较，TGF?β1 mRNA的表达降低（P<0.01）。LPS刺激后可提高大鼠系膜细胞内IL?6 mRNA的表达，与正常对照组比较，模型组IL?6 mRNA表达上升，差异有统计学意义（P<0.01）；祛风通络方组、蒙诺组与模型组比较，IL?6 mRNA表达下降（P<0.01）；祛风通络方降低IL?6 mRNA表达的作用亦优于阳性对照药蒙诺（P<0.01）。 结论: 祛风通络方对大鼠MC增殖及其TGF?β1 和IL?6 mRNA表达均有明显的抑制作用。

【关键词】  祛风通络方 肾小球系膜细胞 中药药理学 转化生长因子β1 白细胞介素6 大鼠

    Objective: To investigate the effects of Qufeng Tongluo Recipe (QFTLR), a compound of traditional Chinese herbal medicine for dispelling wind and removing obstruction in the meridians, on cell proliferation and expressions of transforming growth factor?beta1 (TGF?β1) and interleukin?6 (IL?6) mRNAs induced by lippolysaccharide in glomerular mesangial cells from rats.

    Methods: The method of serum pharmacology was used. A total of 32 rats were divided into normal control group, untreated group, QFTLR group and positive control group which also was named Monopril (fosinopril sodium) group. Mesangial proliferative glomerulonephritis was induced by injection of antithymocyte serum in the rats except for the normal control group. Sera of the rats were obtained after corresponding interventions. Lipopolysaccharide?induced proliferation of rat mesangial cells (MCs) cultured in the respective serum?containing media was detected by the method of methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay, and the expressions of TGF?β1 and IL?6 mRNAs were analyzed by the method of reverse transcription polymerase chain reaction.

    Results: Compared with the untreated group, QFTLR showed remarkable inhibitory function on the proliferation of the mesangial cells (P<0.05). The expressions of TGF?β1 mRNA in mesangial cells were increased in the untreated group, QFTLR group and Monopril group when compared with the normal control group (P<0.01), but the TGF?β1 mRNA expressions in QFTLR group and in Monopril group were lower than that in the untreated group. The IL?6 mRNA expression could be increased by the LPS stimulation, and it was significantly higher in the other three groups than that in the normal control group, including the untreated group, the Monopril group and the QFTLR group (P<0.01). Compared with the untreated group, the expression of IL?6 mRNA was decreased by QFTLR and Monopril (P<0.01). QFTLR was better than Monopril in inhibiting the proliferation of the mesangial cells and decreasing the expressions of TGF?β1 and IL?6 mRNAs (P<0.05).

    Conclusion: QFTLR has great inhibitory effect on mesangial cell proliferation and expressions of TGF?β1 and IL?6 mRNAs, which may be one of its mechanisms in postponing glomerular sclerosis.

    Keywords: Qufeng Tongluo Recipe; mesangial cell; pharmacology (TCD); transforming growth factor?beta1; interleukin?6; rats

    肾小球系膜细胞（mesangial cells, MC）过度增殖及合成细胞外基质增加，是肾小球肾炎发生、及肾小球硬化的重要病理基础。多种损伤因子如免疫复合物、激活的补体成分、脂多糖、细胞因子、血管活性肽、生物活性酯、低密度脂蛋白及基质成分等［1］均可促进系膜细胞的增殖。MC增殖常常是各种肾小球疾病的主要形态表现［2］。在众多细胞因子中，转化生长因子β1（transforming growth factor?beta1, TGF?β1）和白细胞介素6（interleukin?6, IL?6）在肾小球损伤，尤其在肾小球增生性病变中的作用越来越引起重视，因此，抑制MC分泌TGF?β1和IL?6是防治肾小球炎症进展的关键环节之一。笔者采用经验方——祛风通络方(Qufeng Tongluo Recipe, QFTLR)系膜增殖性肾炎（mesangial proliferative glomerulonephritis, MsPGN）获得较好疗效，但其作用机制尚不清楚。现采用血清药理学方法，以脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导后的大鼠MC作为体外研究肾脏病变发生机制和药物疗效作用机制的细胞模型，观察QFTLR对大鼠MC增殖和TGF?β1、IL?6 mRNA表达的影响。

    1  材料与方法

    1.1  实验材料

    1.1.1  实验动物  健康雄性新西兰白兔（合格证号为陕医动字第08?018号）6只，体质量为2.5 kg左右，3～5月龄；雄性SD大鼠（合格证号为陕医动字第08?005号）38只，体质量（200±20）g，均由西安大学医学院实验动物中心提供。

    1.1.2  实验细胞  大鼠MC细胞株，购于典型培养物保藏中心。

    1.1.3  主要试剂  RPMI 1640培养基（含L?谷氨酰胺2 mmol/L）和胰蛋白酶，由Gibco公司提供；甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT），由西安润德试剂公司提供；胎牛血清（fetal calf serum, FCS），由兰州民海生物工程有限公司提供；福辛普利钠片，商品名蒙诺，10 mg/片，批号为0004088，由中美上海施贵宝制药有限公司提供。TRIzol RNA提取试剂，由北京中杉金桥生物技术限公司提供。

    1.1.4  主要仪器  K18台式低温冷冻离心机，Sigma公司；Biomctra聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增仪，UNO?Thermoblock公司；XD101型倒置显微镜，南方江南光电股份有限公司；SW?LG?1F超净台，苏州安泰空气技术有限公司；UV?3000型紫外分析仪，珠海黑马医学仪器有限公司；DYY?III型电泳仪，北京六一仪器厂；Bio?Rad Smart Spcc 3000型核酸蛋白定量分析仪，Bio?Rad公司。

    1.2  实验方法

    1.2.1  系膜增生性肾炎模型的制备及实验分组

    1.2.1.1  兔抗大鼠胸腺细胞血清（antithymocyte serum, ATS）的制备  方法［3］，取雄性健康SD大鼠6只，断头处死后常规摘取大鼠胸腺和肝脏。将肝脏用PBS冲洗干净后制成肝粉待用。将胸腺置于PBS缓冲液中，冲洗2～3次，去除其表面的淋巴结和血管，置200目不锈钢网筛上，用解剖针轻轻划破胸腺游离出胸腺细胞，PBS冲洗，收集胸腺细胞悬液，经1 000 r/min离心10 min，PBS重悬至2×107/ml的胸腺细胞悬液，按体积比1∶2混合胸腺细胞悬液和福氏完全佐剂，充分混匀，以混合后的悬液作为大鼠胸腺细胞免疫抗原液。将大鼠胸腺细胞免疫抗原液多点注射于6只新西兰白兔背部皮下，每只兔子注射3 ml。常规饲养2周后，兔耳缘静脉注射2×107/ml的胸腺细胞悬液，每只注射1.5 ml。7 d后断头处死兔子收集兔血清。用免疫扩散法测抗胸腺细胞血清效价为1︰160～1︰320。抗胸腺细胞血清于56 ℃灭活30 min后，用同个体大鼠肝粉吸附非特异性抗体，室温离心30 min，弃去肝粉，收集ATS，－20 ℃保存备用。

    1.2.1.2  系膜增殖性肾炎大鼠模型制备  将32只雄性健康SD大鼠适应性喂养1周，自由摄食（普通固体饲料）及饮水。按随机数字表法随机分为正常对照组、系膜增殖性肾炎模型组、蒙诺组和祛风通络方组，每组8只。除正常对照组外，其余各组一次性尾静脉注射ATS 2 ml，诱发系膜增殖性肾炎大鼠模型；正常对照组一次性注射等量生理盐水。

    1.2.2  祛风通络方药物血清及对照血清冻干粉的制备  造模6 d后开始灌胃给药。祛风通络方由黄芪、海风藤、青风藤、乌梢蛇和生地黄等组成。购于西安交通大学医学院第二附属中药房。祛风通络方水煎液浓缩浓度为0.945 g/ml（以生药质量），大鼠灌胃剂量为10 ml/(kg·d)。将蒙诺10 mg溶于40 ml蒸馏水中配制成0.25 mg/ml混悬液，按剂量为0.92 mg/(kg·d)（根据人和动物间体表面积折算的等效剂量比值表换算）灌胃，持续8 d。模型组和正常对照组予相同体积的生理盐水灌胃。正常对照组、模型组和祛风通络方组大鼠用药14 d，于末次灌胃2 h后、蒙诺组大鼠末次给药4 h后，无菌条件下腹主动脉采血，无菌分离血清，56 ℃水浴灭活30 min，0.22 μm过滤器过滤除菌，分装入EP管，置入真空干燥瓶中制成干粉。－80 ℃冰箱保存备用。实验时将0.2 ml血清的冻干粉溶解于0.05 ml蒸馏水中。

    1.2.3  MTT法检测MC增殖  取对数生长期MC，以5×104/m1浓度接种于96孔培养板中。待MC贴壁铺满形成单层细胞后，换为含1% FCS的RPMI 1640培养液，150 μl/孔。培养24 h使所有细胞的生长同步于G0期，分为正常对照组、模型组、蒙诺组和祛风通络方组。正常对照组和模型组于培养液中加正常大鼠血清。祛风通络方组加祛风通络方药物血清，蒙诺组加蒙诺药物血清，上述各组设6个复孔。每组每孔各加冻干粉溶解液50 μl，总体积200 μl/孔。除正常对照组外，其余各孔予10 μg/ml LPS 50 μl刺激MC增殖72 h。将MTT溶液（5 mg/ml）加入96孔板中，20 μl/孔，继续培养4 h，选择490 nm波长，在酶标仪上读取光密度（optical density, OD）值。

    1.2.4  逆转录聚合酶链反应法检测TGF?β1和IL?6 mRNA表达

    1.2.4.1  总RNA的提取  将MC放入培养瓶中，3瓶为一组，分组及给药方法同MTT实验，给药24 ｈ后，收集洗涤各组细胞，加入TRIzol 1 ml，移入0.1%焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate, DEPC）处理过的EP管中，静置5 min。避光加入氯仿200 μl，剧烈振荡15 s，静置10 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min。将上层水相0.5 ml移入另一EP管中，加入异丙醇500 μl，振荡混匀，静置10 min沉淀RNA。4 ℃、12 000 r/min离心15 min后去上清。加入DEPC处理的75%乙醇1 ml垂直振荡后，4 ℃、8 000 r/min离心10 min，去上清，通风橱中干燥RNA 5～10 min，加入无RNA酶水 50 μl溶解RNA。

    1.2.4.2  RNA电泳  取10×甲醛变性电泳缓冲液1.25 μl、37%甲醛2.2 μl和甲酰胺6.25 μl组成电泳混合液。加入5 μl RNA，1 000～2 000 r/min离心10 s，55 ℃加热15 min。加入2.5 μl甲醛凝胶上样缓冲液，混合离心5 s，将样品加点样孔，在5 V/cm电压下电泳1 h，自动凝胶成像分析下观察结果，鉴定RNA完整性。同时取2 μl用核酸蛋白定量分析仪测OD 260、OD280值，重复测定3次。根据OD260/OD280值判断RNA纯度。其余RNA置－70 ℃保存。

    1.2.4.3  设计大鼠IL?6、TGF?β1及β?actin引物序列  由GenBank数据库中获得基因引物序列，采用Primer Expresion 2.0软件（美国 Applied Biosystem Inc）进行计算机辅助设计，由北京华大中生科技有限公司合成。TGF?β1引物序列：上游引物5'?CTT CAG CTC CAC AGA GAA GAA CTG C?3'；下游引物5'?CAC GAT CAT GTT GGA CAA CTG CTC C?3'。β?actin序列：上游引物5'?TCC TAG CAC CAT GAA GAT C?3'；下游引物5'?AAA CGC AGC TCA GTA ACA G?3'。TGF?β1基因扩增片段长度为254 bp，β?actin基因扩增片段长度为190 bp。IL?6引物序列：上游引物5'?GAC TGA TGT TGT TGA CAG CCA CTG C?3'；下游引物5'?TAG CCA CTC CTT CTG TGA CTC TAA CT?3'。β?actin：上游引物5'?AGG CCG GCT TCG CGG GCG AC?3'；下游引物5'?CAG GGG AGC CAC ACG CAG CTC?3'。IL?6基因扩增片段长度为509 bp，β?actin基因扩增片段长度为243 bp。

    1.2.4.4  逆转录聚合酶链式反应  逆转录反应：5×逆转录缓冲液2 μl，下游引物（25 μmol/L）0.5 μl，dNTPs（10 mmol/L）1 μl，MMLV（10 U/μl）1 μl，DEPC 3.5 μl，RNA模板2 μl，总体积为10 μl。反应条件为37 ℃ 1 h， 95 ℃ 3 min。PCR反应：5×PCR缓冲液 10 μl，上游引物（25 μmol/L）1 μl，下游引物（25 μmol/L）1 μl，dNTPs (10 mmol/L) 1 μl，Taq酶2 μl，cDNA 5 μl，ddH2O 30 μl，总体积为50 μl。反应条件：93 ℃ 2 min，然后93 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，共40个循环，72 ℃ 7 min延伸。以β?actin作为内对照，扩增条件同上。取10 μl TGF?β1 mRNA反应产物于2%琼脂糖凝胶电泳30 min，取10 μl IL?6 mRNA反应物与1.2%琼脂糖凝胶电泳。紫外分析仪下检测、拍照，并用LEICAQ?500IW图像分析处理系统进行分析，分析各条带光密度值，结果以TGF?β1、IL?6 mRNA与各自β?actin的光密度比值表示。

    1.3  统计学方法  数据采用SPSS 11.5 统计分析软件进行处理。计量资料数据以x±s表示,两样本均数的比较用t检验，多样本均数间的比较用q检验。

    2  结  果

    2.1  含祛风通络方血清对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响  与正常对照组比较，LPS可明显刺激肾小球系膜细胞增殖(P<0.05)。与模型组比较，祛风通络方组MC增殖受到抑制（P<0.05），且作用优于蒙诺组（P<0.05），且与正常对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1和图1.

    2.2  含祛风通络方血清对LPS刺激后MC TGF?β1和IL?6 mRNA表达的影响  用蛋白核酸分析仪测定RNA样品在260 nm和280 nm处的光密度值比值在1.8～2.0之间，表明RNA纯度较好。LPS刺激后可提高大鼠系膜细胞内TGF?β1 mRNA的表达，与正常对照组比较，模型组、祛风通络方组和蒙诺组TGF?β1 mRNA表达上升，差异有统计学意义（P<0.01）；祛风通络方组、蒙诺组和模型组比较，TGF?β1 mRNA表达下降（P<0.01）；祛风通络方组与蒙诺组比较，也可降低TGF?β1 mRNA的表达（P<0.01）。LPS刺激后可提高大鼠系膜细胞内IL?6 mRNA的表达，与正常对照组比较，模型组、祛风通络方组和蒙诺组TGF?β1 mRNA表达上升，差异有统计学意义（P<0.01）；祛风通络方组、蒙诺组与模型组比较，IL?6 mRNA表达下降（P<0.01）；祛风通络方降低IL?6 mRNA表达的作用亦优于阳性对照药蒙诺（P<0.01）。见表2和图2、图3。 表1  含祛风通络方血清对LPS刺激后MC增殖的影响表2  含祛风通络方血清对MC TGF?β1和IL?6 mRNA表达的影响

    3  讨  论

    MC是肾小球内非常活跃的细胞，具有分泌细胞基质、产生细胞因子、吞噬和清除大分子物质及类似平滑肌细胞收缩的功能，在维持正常肾脏生理功能和肾脏疾病的发生中起重要的作用。MC过度增殖引起细胞外基质成分合成的增加，进而导致细胞外基质在肾小球内的蓄积，是肾小球硬化发生、发展的重要机制，亦是造成肾脏功能进行性损害的重要环节。因此，若能有效地抑制系膜细胞异常增殖，则可阻碍肾小球硬化的形成，防止肾功能的恶化［4］。本实验研究了祛风通络方对LPS刺激下的大鼠MC增殖的作用，通过测定药物血清对其增殖的抑制作用，和测定能够促进MC增殖的细胞因子TGF?β1和IL?6 mRNA表达，希望找到祛风通络方对系膜增殖性肾炎的可能机制。考虑到现实生活中服用药物的人都是处在病理状态下的，病理状态下的含药血清肯定会与正常状态下的含药血清不同，为了更准确地反映祛风通络方的作用机制，本实验采用系膜增殖性肾炎大鼠模型的含药血清考察其机制。

    本实验研究表明，LPS可明显刺激MC增殖（P<0.05）；与模型组相比，祛风通络方可明显抑制细胞增殖（P<0.05），且作用优于阳性对照药蒙诺（P<0.05），与正常对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。说明祛风通络方治疗组对MC的生长有抑制作用。

    在肾脏内，TGF?β1主要来源于MC、上皮细胞、内皮细胞、肾小管上皮细胞及浸润的单核细胞。肾脏是TGF?β1的重要靶器官。研究证实，TGF?β1在各种进行性肾脏疾病发展为纤维化中起重要作用［5］，其原因现在已深入到信号转导方面［6］。TGF?β1通过两条途径导致肾小球硬化：可促进MC增殖，调节细胞外基质（extracellular matrix, ECM）降解机制中最重要的两个系统PA/纤溶酶系统和MMP系统促进ECM合成，抑制ECM的降解，加速其在肾小球系膜区的积聚；TGF?β1本身有自我放大作用，以自分泌方式形成一个自分泌活化增生环，刺激MC合成和分泌更多的TGF?β1，从而促进其基因表达水平升高［7］。本实验显示，经LPS刺激后MC TGF?β1 mRNA的表达增强，正常对照组与模型组、祛风通络方组、蒙诺组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。祛风通络方治疗组与模型组相比TGF?β1 mRNA的表达显著降低（P<0.01），且祛风通络方的作用优于阳性对照药蒙诺（P<0.01）。提示祛风通络方具有显著的抑制TGF?β1基因表达的作用，这可能是该方产生疗效的机制之一。

    IL?6作为系膜细胞的自分泌因子，在生理状态下对肾小球内细胞介导的免疫功能起重要的调节作用；但在病理状态时，通过自分泌或旁分泌的途径却直接参与肾小球炎症，尤其是IL?6可刺激系膜区的MC增殖和细胞外基质分泌的增多，形成恶性循环，从而加重病理损害［8］。因此，有效地抑制MC增殖，以及对疾病状态下IL?6的有效调控有利于控制慢性肾脏疾病的发展，延缓肾功能恶化。本实验结果显示，LPS刺激可提高大鼠MC内IL?6 mRNA的表达；正常对照组与模型组、祛风通络方组、蒙诺组相比，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组和蒙诺组比较，祛风通络方可显著降低IL?6 mRNA的表达（P<0.01）。提示祛风通络方具有显著的抑制IL?6基因表达的作用，这可能亦是其治疗有效的机制之一。

    笔者认为肾病是一种络病，是肾络疾病。其本是肾络空虚，其因之一是风邪伏于空虚之肾络，且寒、湿、热、毒等邪兼夹，久而肾络瘀滞不通，发为肾病。因此，治疗上从病因入手，祛肾络之风邪为主，兼补肾络之虚损和通肾络之瘀滞，充分立足于肾病的中医病机特点，故创立祛风通络法和方剂。方中乌梢蛇祛风通络为君药；青风藤、海风藤祛风胜湿、通络共为臣药；佐以黄芪益气固表祛风；使以生地黄养阴生津，既防诸药之燥，又引诸药入肾经。全方体现祛风通络、益气补肾之功。从药理研究而言，该方所体现的免疫调节、抗凝、溶栓及抗增生作用，亦符合肾小球肾炎病理机制。本实验结果表明，祛风通络方对大鼠的MC增殖及其TGF?β1和IL?6 mRNA表达均有明显的抑制作用。这可能是其具有疗效的原因之一，至于祛风通络方的作用途径还需作进一步研究。

【】
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