补肾柔肝方对二甲基亚硝胺诱导大鼠肝纤维化的预防作用及其机制研究

【摘要】  探讨补肾柔肝方对二甲基亚硝胺（dimethylnitrosamine, DMN）诱导大鼠肝纤维化的预防作用及初步机制。方法：雄性Wistar大鼠40只，随机分为正常对照组（n=10）、模型组（n=15）及补肾柔肝方预防组（n=15）。模型组和补肾柔肝方预防组以10 mg/kg DMN腹腔注射，1次/d，每周连续3 d，共4周。模型组在造模同时给予生理盐水灌胃，补肾柔肝方预防组在造模同时给予补肾柔肝方灌胃，共4周；第4周末处死全部大鼠，留取血清及肝组织标本。采用全自动生化分析仪检测血清总胆红素（total bilirubin, Tbil）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase, AST）、白蛋白等；应用逆转录聚合酶链式反应法检测肝组织结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）和Ⅰ型胶原mRNA的表达。 结果：补肾柔肝方预防组大鼠一般状态明显好于模型组；模型组大鼠死亡率为13.33%（2/15），补肾柔肝方预防组死亡率为6.67%（1/15）；模型组大鼠腹水发生率为46.67%（7/15），补肾柔肝方预防组大鼠腹水发生率为20%（3/15），两组比较差异有统计学意义（P<0.01）；补肾柔肝方组肝功能较模型组有显著改善（P<0.01）。模型组肝组织CTGF和Ⅰ型胶原mRNA表达明显增强，补肾柔肝方预防组与模型组相比明显减弱（P<0.01）。结论：补肾柔肝方可通过抑制大鼠肝组织CTGF和Ⅰ型胶原mRNA的表达，达到抗肝纤维化的作用。

【关键词】  补肾柔肝方 肝纤维化 二甲基亚硝胺 结缔组织生长因子 Ⅰ型胶原 大鼠

    Objective: To study the effects of Bushen Rougan Recipe (BSRGR), a compound traditional Chinese herbal medicine, on hepatic fibrosis in rats induced by dimethylnitrosamine (DMN), and to explore its preliminary mechanism.

    Methods: A total of 40 male Wistar rats were randomly divided into normal control group (n=10), untreated group (n=15), and BSRGR group (n=15). Except for the rats in normal control group, hepatic fibrosis in rats was induced by peritoneal injection of DMN for 4 weeks. And the rats in the BSRGR group were also intragastrically administered BSRGR within the 4?week course. At the end of the 4?week course, rats were all sacrificed. The liver functions were determined by automatic biochemistry analyzer, including serum total bilirubin (Tbil), alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), and albumin. Expressions of connective tissue growth factor (CTGF) and collagen type Ⅰ mRNA in liver tissue were detected by reverse transcription polymerase chain reaction.

    Results: It was found that the serum Tbil level and the activities of AST, ALT were declined in the BSRGR group as compared with those in the untreated group (P<0.01). The serum albumin content in the BSRGR group was increased as compared with that in the untreated group (P<0.01). The expressions of collagen type Ⅰ and CTGF mRNAs in the untreated group were higher than those in the BSRGR group (P<0.01).

    Conclusion: BSRGR can decrease the expressions of collagen type Ⅰ and CTGF mRNAs in the rats with hepatic fibrosis, which may be one of possible mechanisms in treating hepatic fibrosis.

    Keywords: Bushen Rougan Recipe; hepatic fibrosis; dimethylnitrosamine; collagen type Ⅰ; connective tissue growth factor; rats

    慢性肝病是比较常见的疾病，如不能及时诊断和，容易为肝硬化，甚至肝癌。其一旦发展为肝硬化往往很难逆转，但早期的肝纤维化经过有效治疗后是可以逆转的，因而国内外许多专家非常重视肝纤维化的研究。有关肝纤维化发病机制的研究报道很多，其中结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）和Ⅰ型胶原的表达与肝纤维化的关系较为密切，已受到人们的重视［1?4］。本研究运用二甲基亚硝胺（dimethylnitrosamine, DMN）诱导大鼠肝纤维化模型，运用补肾柔肝方（Bushen Rougan Recipe，BSRGR）进行预防，以观察中药复方抗肝纤维化的效果，同时观察补肾柔肝方对肝组织Ⅰ型胶原和CTGF mRNA表达水平的影响。

    1  材料和方法

    1.1  实验材料  雄性Wistar大鼠40只，清洁级，体质量（150±10）g，购于院上海实验动物中心。补肾柔肝方（仙灵脾9 g、炙鳖甲12 g、黄芪12 g、枸杞15 g、白术12 g、丹参15 g等），由上海中医药大学曙光制剂室提供，制备成含生药1.6 g/ml的流浸膏灌胃液；DMN购自日本东京化成株式会社；7020型自动生化分析仪购自日本Hitachi公司。

    1.2  实验方法

    1.2.1  造模及分组  将大鼠随机分为正常对照组（n=10）、模型组（n=15）及补肾柔肝方预防组（n=15）。用生理盐水将DMN稀释为0.5%DMN溶液（v/v），模型组和中药预防组大鼠以10 mg/(kg·d) DMN腹腔注射，每周连续3 d，共4周［5］。补肾柔肝方预防组在造模同时给予补肾柔肝方10 ml/(kg·d)灌胃，共用药4周；正常对照组和模型组每天给予生理盐水灌胃（等体质量的DMN毫升量使用）。实验过程中观察大鼠一般情况，于4周末下腔静脉采血，离心分离血清，并留取大鼠肝组织标本。

    1.2.2  生化指标检测  采用全自动生化分析仪检测血清总胆红素（total bilirubin, Tbil）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase, AST）、白蛋白含量。

    1.2.3  逆转录聚合酶链式反应检测肝组织CTGF和Ⅰ型胶原mRNA的表达  分别取正常对照组、模型组和补肾柔肝方预防组各3只大鼠的肝组织进行研究，CTGF引物序列（产物383 bp）：上游引物为5'?CTA AGA CCT GTG GAA TGG GC?3'；下游引物为5'?CTC AAA GAT GTC ATT GTC CCC?3'。Ⅰ型胶原引物（产物225 bp）：上游引物为5'?CTT TGC TTC CCA GAT GTC C?3'；下游引物为5'?TCC CCA TCA TCT CCG TTC?3'；β?肌动蛋白（β?actin）引物（内参照物，产物300 bp）：上游引物为5'? TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACG A?3'；下游引物为5'?TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACG A?3'。所有引物均由国家南方基因中心设计合成。TRIzol抽提肝组织RNA，进行逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction, RT?PCR）扩增。PCR反应体系为20 μl。扩增条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃复性30 s，共30～35个循环；最后72 ℃延伸7 min。每次PCR反应均以无菌双蒸水代替cDNA模板作为阴性对照。取7 μl PCR产物在15 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳，紫外线下观察结果，并在凝胶电泳分析系统下拍照。求出每条带的光密度值，以β?actin PCR产物作为内参照。求出每条目的条带与β?actin条带光密度值的比值，进行统计学处理。

    1.3  统计学方法  所有实验数据采用SPSS 10.0软件进行统计学分析，计量资料用x±s表示。组间比较采用卡方检验、t检验和单因素方差分析。

    2  结  果

    2.1  大鼠一般情况观察  正常对照组大鼠生长状态良好，体质量增加显著，皮毛光滑，大小便正常；模型组大鼠活动少，精神萎靡，胡须下垂，喜睡少动，体质量无明显增加，皮毛欠光滑，尿色黄，有腹泻；补肾柔肝方预防组大鼠一般状态明显好于模型组。正常大鼠无死亡，而模型大鼠死亡率为13.33%（2/15），补肾柔肝方预防组死亡率为6.67%（1/15）。正常大鼠无腹水，模型组大鼠腹水发生率为46.67%（7/15），补肾柔肝方预防组大鼠腹水发生率为20%（3/15），两组比较差异有统计学意义（P<0.01）。

    2.2  补肾柔肝方对大鼠肝功能的影响  模型组大鼠血清酶学水平高于正常对照组（P<0.01），血清白蛋白水平下降明显（P<0.01），补肾柔肝方预防组血清酶学水平低于模型组（P<0.01），同时白蛋白水平高于模型组（P<0.01）。见表1。

    2.3  补肾柔肝方对肝组织CTGF和Ⅰ型胶原mRNA表达的影响  模型组CTGF/β?actin、Ⅰ型胶原/β?actin的比值分别为1.08±0.17和0.84±0.08，补肾柔肝方预防组分别为0.76±0.10和0.62±0.04，两组比较差异有统计学意义（P＜0.01），而正常对照组分别为0.28±0.03和0.50±0.04，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。CTGF和Ⅰ型胶原mRNA基因扩增电泳结果如图1和图2所示。表1  各组大鼠血清ALT、AST活性和Tbil、白蛋白水平

    3  讨  论

    中医药防治肝胆疾病（如黄疸、臌胀、胁痛等），已有悠久的，大量临床实践也证实其疗效。补肾柔肝方攻补兼施，攻而不破，补而不腻，攻补力量较为平均，其以仙灵脾、枸杞和鳖甲等以补肾而软坚散结；黄芪、白术健脾，以益气生血；丹参补血活血。诸药合用，共奏补肾健脾活血软坚之功，是预防和治疗慢性肝病肝纤维化脾肾亏虚、瘀血内阻的安全、有效的中药处方。其独到之处在于注重肾在肝病发病过程中的作用，认为肝纤维化发生与机体正气亏虚有关，提出从肾治肝、扶助正气的治肝观点，符合中医基础理论中的“肝肾同源”的原理，在先前的研究中也证实具有良好的抗肝纤维化作用［6, 7］。本研究表明，补肾柔肝方可以使ALT、AST、Tbil不同程度地改善，同时显著提高白蛋白水平，显示补肾柔肝方能有效改善肝纤维化大鼠的肝功能。

    目前认为肝纤维化是肝损伤持续存在，使肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）激活，造成肝脏组织发生修复过程中细胞外基质（extracellular matrix, ECM）合成、降解与沉积不平衡而引起，是涉及复杂的细胞及分子机制的动态过程，受到多种信号转导的调控［8, 9］。正常肝内ECM占肝湿重的0.5%，可分为细胞间基质、间质基质和基底膜基质。ECM的成分包括胶原、非胶原糖蛋白、蛋白多糖及弹性硬蛋白等，其中胶原是结缔组织的主要成分，其中主要为Ⅰ型和Ⅲ型（各占33%），可见Ⅰ型胶原的表达情况与肝纤维化的程度关系比较密切，可以作为肝纤维化进展程度判断的依据之一［1］。我们在本研究中也发现，模型组大鼠Ⅰ型胶原的表达明显增强，而正常大鼠表达较少，模型大鼠经过中药预防后有显著改善的趋势，表明补肾柔肝方具有良好的抗肝纤维作用。细胞因子作为促进肝纤维化的重要调节因子的作用已较明确，尤其是转化生长因子β（transforming growth factor?β, TGF?β）、组织金属蛋白酶组织抑制剂1（tissue inhibitor of metalloproteinase?1, TIMP?1）和血小板衍生生长因子（platelet?derived growth factor, PDGF）等在肝纤维化形成过程中的作用比较明确［10?12］。尽管如此，人们对肝纤维化的发病机制还不清楚。目前许多其他细胞因子的作用也引起人们的高度重视，其中CTGF与肝纤维化的关系也受到很多学者的关注。CTGF是高度保守的CCN多肽家族成员之一，分子量38 D，含349个氨基酸，富含半胱氨酸，具有明显的丝裂原性和趋化性，能诱导成纤维细胞增殖和分泌细胞外基质，参与调节细胞增生、分化、胚胎发育以及伤口愈合。Li等［13］认为CTGF具有促进炎症和纤维化形成的作用。George等［14］运用DMN诱导大鼠肝纤维化后发现，肝组织的CTGF和TGF?β表达均显著提高，运用针对CTGF的小干扰RNA（siRNA）进行干预，可以下调CTGF和TGF?β的表达，有抑制肝纤维化的形成和的作用。Weng等［15］认为，CTGF具有上调TGF?β活性的作用，从而促进肝纤维化的形成和发展，其机制可能与纤维化发生过程中的细胞信号转导激活有关，其中Smad3、Smad7等信号蛋白参与其发病的过程。Hora等［16］发现，在丙型肝炎患者，CTGF是促进肝纤维化的炎症介质，可能是通过提高瘦素水平来实现的。本研究结果显示，补肾柔肝方可以显著减少肝组织CTGF mRNA表达水平。提示补肾柔肝方对肝纤维化具有较好的预防作用，其抗肝纤维化的分子机制可能与下调CTGF和Ⅰ型胶原的表达有关，可以使HSC的活化得到抑制，从而减少肝纤维化的发生和发展。有关其抗肝纤维化的机制仍需要做进一步研究。

【】
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