竹荪提取液对砷中毒小鼠免疫功能的保护作用
作者：王潫，罗鹏，张爱华，张开菊，吴海
【摘要】 目的： 探讨竹荪提取液对As2O3引起小鼠免疫毒性的防护作用。方法： 建立As2O3急性砷中毒模型小鼠，研究竹荪提取液对小鼠体重、脏器系数、总补体溶血活性（CH50）、淋巴细胞增殖、巨噬细胞吞噬功能的影响。结果： 与正常对照组相比，砷中毒组小鼠体重、脏器指数无明显改变；CH50、淋巴细胞增殖、巨噬细胞吞噬率及吞噬指数明显降低，差异有显著性（P<0.05或P<0.01）；与砷中毒组相比，竹荪低剂量组小鼠体重、脏器指数、CH50、淋巴细胞增殖、巨噬细胞吞噬率及吞噬指数无明显改变化；竹荪治疗高剂量组除小鼠体重、脏器指数无明显改变外,CH50、淋巴细胞增殖、巨噬细胞吞噬率及吞噬指数明显升高，差异有显著性（P<0.05或P<0.01）。结论： 竹荪提取液对As2O3引起的砷中毒小鼠的免疫毒性有一定的保护作用。
【关键词】 免疫力； 竹荪； 砷中毒； 体重； 补体溶血活性测定； 淋巴细胞； 巨噬细胞； 吞噬作用
［Abstract］ Objective: T o investigate the protective effects possibly exist in extract from Dictyophora( EXD) on immunosystem of mice against the injury caused by As2O3. Methods: Acute immunotoxicity model of mice was made with As2O3. The effect of EXD on body weight, organ indexes, total hemolysin complement levels (CH50), lymphocyte accruing rates, and macrophocyte phagocytosis of mice were observed. Results： In acute experiment, there was no significant difference of body weight or organ indexes between the normal control and arsenic poisoning groups；while the CH50 level, lymphocyte accruing rate, phagocytosis rate and macrophagocyte index in arsenic poisoning group were significantly lower (P<0.05 or P<0.01) than those in normal group. There was no significant difference of body weight or organ index between arsenic poisoning group and EXD (10 g) treated arsenic poisoning group, while CH50, lymphocyte accruing rate, phagocytosis rate, and mavrophocyte index were significantly higher in EXD (10 g) treated arsenic poisoning group than those in arsenic poisoning group (P<0.05 or P<0.01). In EXD (5 g) treated arsenic poisoning group, results of all the tested indexes were the same as those of arsenic poisoning group. Conclusion: EXD has some protective effects to experimental mice against acute immunotoxicity caused by arsenic poisoning.
［Key words］ immunity; Dictyophora; arsenic poisoning; body weight; complement hemolytic activity assay; lymphocytes; macrophages; phagocytosis
地方性砷中毒是一种严重威胁人类健康的疾病，可以引起神经、泌尿、消化、心血管、免疫、内分泌等多系统、多器官的损伤，甚至可以引起肿瘤的发生[1，2]。竹荪是一种食、药两用真菌，有学者观察到竹荪托盖液对辐射损伤大鼠免疫系统有一定的修复作用[3]，但对砷引起的免疫损伤是否具有保护作用却未见报道。在既往竹荪提取液抗突变和抗氧化损伤研究的基础上[4，5]，本实验进一步研究竹荪提取液对急性砷中毒小鼠免疫系统的损伤是否具有保护作用，为地方性砷中毒的防治提供依据。
1 材料与方法
1.1 主要仪器
酶标仪MQX200（美国BiO-TEK公司）、CO2培养箱（日本三洋公司）、TGLL-18台式高速离心机（北京长源实验设备厂）、HH-8恒温水浴箱（上海申化仪表自控公司）。
1.2 主要试剂
As2O3(AR)由公共卫生学院中心实验室提供，溶血素由浙江省玉环县南方试剂厂生产，小牛血清由杭州四季青有限公司生产，细胞培养液RPMI1640由Hyclome公司生产。
1.3 竹荪提取液竹荪干品由贵州省野生资源开发保护研究中心生产。准确称取竹荪干品50 g加500 ml双蒸水浸泡3 h，制成匀浆，煮沸30 min后用200目滤筛过滤，将滤液浓缩至200 ml，所得竹荪提取液浓度为0.25 g/ml，4 ℃冰箱保存备用。
1．4 动物及分组健康昆明种小鼠180只，雌雄各半，体重28～32 g，由贵阳医学院实验动物中心提供。平均分为3批，每批60只，每批随机分为6组，每组10只；每批分组及剂量均相同。正常对照组，竹荪高剂量、低剂量组（10 g/kg、5 g/kg），砷中毒模型组(As2O3 5 mg/kg)，竹荪治疗高剂量和低剂量组（竹荪10 g/kg、5 g/kg）。砷中毒模型组和竹荪治疗组用As2O3按5 mg/kg标准造模，1次/d，连续7 d；竹荪治疗组在造模的每天下午给竹荪治疗，灌胃量0.02 ml/g。
1.5 实验相关试剂的配制
1.5.1 绵羊红细胞悬液(SRBC)
健康成年绵羊颈静脉处局部消毒采血，加入等体积阿氏细胞保存液(Alsever's)，4 ℃保存。临用前用巴比妥缓冲液洗涤3次，2 000 r/min离心5 min，弃上清液。
1.5.2 巴比妥缓冲液（）
准确称取NaCl 85 g、巴比妥 5.75 g、巴比妥钠 3.75 g、MgCl21.017 g、无水CaCl2 20.066 g，将巴比妥钠溶于双蒸馏水中，依次溶解上述试剂，双蒸馏水定容至1 000 ml，高压蒸气灭菌20 min，4 ℃冰箱中保存。
1.5.3 营养肉汤及6%淀粉肉汤配制
牛肉浸膏0.3 g、蛋白胨1.0 g、NaCl 0.5 g，加入100 ml双蒸馏水中，微火加热溶解，高压蒸汽灭菌20 min，4℃冰箱中保存。在营养肉汤中加入可溶性淀粉6 g。
1.6 观察指标
实验结束时准确称量实验小鼠体重，颈椎脱臼法处死小鼠，取肝脏、肾脏、脾脏并称重，脏器指数。用分光光度比色法检测CH50活性，四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测T淋巴细胞的增殖功能，显微计数法检测并计算巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数。
1.7 统计方法
采用SPSS 10.0统计软件进行分析，实验结果用（x±s）表示，采用方差分析及t检验。
2 结果
2.1 小鼠体重和脏器指数各组小鼠的体重、肝脏、脾脏和肾脏指数均无显著性差异。见表1。表1 各组上鼠小鼠体重及脏器指数比较（略）注：脏器指数=[脏器重量(g)/小鼠体重(g)]×100%。
2.2 CH50淋巴细胞增殖、吞噬率及吞噬指数
由表2可见，与正常对照组相比，砷中毒组CH50显著降低，差异具有显著性（t =3.345,P=0.032<0.05）；竹荪5 g、10 g组CH50与正常组比较差异无显著性。与砷中毒组相比，竹荪5 g组CH50有升高趋势，但无显著性差异；竹荪治疗10 g组CH50显著升高，差异具有显著性（F=4.923,P<0.01）。与正常对照组相比，砷中毒组淋巴细胞增殖功能显著降低，差异有显著性（t=2.150，P<0.05）；竹荪5 g、10 g组淋巴细胞增殖功能与正常对照组比较差异无显著性。竹荪治疗5 g组淋巴细胞增殖功能与砷中毒组相比，差异无显著性；竹荪治疗10 g组淋巴细胞增殖功能与砷中毒组比较明显升高，差异具有显著性（F=2.703，P<0.05）。与正常对照组相比，砷中毒组吞噬率显著降低，差异有显著性（t =3.170，P≦0.05）；吞噬指数显著降低，差异有显著性（t =4.009，P=0.01）。竹荪5 g、10 g组吞噬率和吞噬指数与正常对照组比较差异无显著性。与砷中毒组相比，竹荪治疗5 g组和竹荪治疗10 g组吞噬率明显升高，差异有显著性（F=23.005，P<0.01，P≤0.01）；吞噬指数明显升高，差异有显著性（F=27.175, P<0.01）。表2 各组小鼠CH50、淋巴细胞增殖功能、巨噬细胞吞噬率和吞噬指数比较（略）注：A，吸光度值的差值，反映淋巴细胞增殖功能；与正常对照组比较(1)P<0.05, (2)P<0.01；与砷中毒组比较（3）P<0.05，（4）P<0.01。
3 讨论
砷对机体的先天免疫、体液免疫、细胞免疫以及非特异性免疫产生一定程度的毒性作用，也可以影响机体免疫器官的发育。本次实验采用As2O3对小鼠经口灌胃染毒7 d并检测免疫系统的相关指标。实验结果表明，与正常对照组比较，砷中毒组小鼠体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫功能均降低，差异具有显著性，说明砷中毒小鼠免疫损伤模型建立成功。
肝脏和肾脏不仅在物质代谢过程中具有重要作用，而且有分泌、排泄和生物转化的功能；脾脏既是T、B淋巴细胞发育的场所，含有大量的浆细胞、巨噬细胞和树突状细胞等，还具有产生吞噬细胞增强激素，起到增强巨噬细胞和中性粒细胞的吞噬功能。实验结果显示，各组在肝脏、肾脏、脾脏系数指标上均无显著性差异。考虑其原因，可能是本次实验染毒时间短，进入体内的大部分砷随尿液和粪便排出体外，尚不能对机体和免疫器官发育产生明显的影响，这与报道相一致[6]。
CH50是具有酶样活性的球蛋白，广泛参与机体的抗感染防御反应，具有介导细胞溶解、调理吞噬、免疫黏附以及参与炎症反应等引起机体免疫损伤的作用。T淋巴细胞是细胞免疫的执行者，其数量及活性的变化可以反映机体免疫功能变化。吞噬细胞具有多种生物学功能，能够产生多种细胞因子，参与机体的免疫应答和免疫调节，其吞噬能力是衡量机体非特异性免疫功能的指标之一。通过测定巨噬细胞对绵羊红细胞的吞噬率和吞噬指数可以反映其吞噬功能的强弱。实验结果显示，与正常对照组比较，竹荪组CH50、淋巴细胞增殖率、吞噬百分率、吞噬指数无显著性差异，表明竹荪提取液对小鼠免疫指标在短期内无明显影响；而砷中毒组小鼠CH50、淋巴细胞增殖率、吞噬、吞噬指数均降低，有显著性差异(P<0.05)，表明砷可以抑制T细胞增殖，引起CD4+T细胞数量减少；同时，砷对体液免疫有一定程度的抑制作用，引起总补体溶血活性下降。巨噬细胞吞噬率和吞噬指数显著下降表明砷对单核巨噬细胞系统产生影响，从而影响到非特异性免疫功能，提示在砷中毒研究中早期观察免疫指标的变化，有利于发现砷对人体健康的损害，有利于早期进行防治[7，8]。砷对巨噬细胞功能产生抑制作用的机制目前尚不清楚，有研究表明，砷可以通过RhoA-ROCK信号途径抑制巨噬细胞功能，引起巨噬细胞数量减少，降低机体对外界有害因素的抵抗力[9]。还有研究表明，砷通过抑制哺乳动物淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞的活力，引起免疫抑制[10]，通过干扰糖皮质激素代谢来影响免疫系统，或通过诱导细胞凋亡降低机体免疫应答。本次实验结果说明了在急性毒性试验中，砷可以引起一定程度的免疫抑制，但是否存在剂量依赖关系，目前尚不清楚[11]。
目前对砷中毒的治疗还缺乏有效的手段，排砷药物、中药制剂、拮抗剂等是常用的治疗药物。竹荪含有丰富的多糖、糖蛋白、微量元素、维生素和人体必需氨基酸，具有增强人体免疫力、抗氧化损伤和抗肿瘤的活性[12]。实验结果显示，竹荪治疗5 g组淋巴细胞增殖功能、CH50和巨噬细胞吞噬功能无明显变化，竹荪治疗10 g组的淋巴细胞增殖功能、CH50以及巨噬细胞吞噬功能均显著升高，说明在一定剂量条件下，竹荪通过促进砷中毒小鼠淋巴细胞增殖、增强T淋巴细胞功能、提高补体活性来增强体液免疫功能；还通过增加巨噬细胞数量或活力而增强巨噬细胞吞噬功能，对砷中毒小鼠的免疫损伤具有一定的防护作用，降低砷诱发的免疫毒性作用。
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