致倦库蚊Cecropin基因克隆及序列分析

【摘要】  　　目的：克隆致倦库蚊Cecropins基因序列，并进行生物信息学分析。方法： 选取致倦库蚊成虫，提取其DNA并以此为模板，设计一对引物，采用PCR技术扩增出Cecropins基因，应用相关生物信息学软件分析其序列。结果： 克隆出致倦库蚊Cecropins基因，并测定其扩增产物序列，经同源对比确认，进行了相关序列分析。结论： 获得致倦库蚊Cecropins基因序列，基因长度为259 bp，与尖音库蚊一致性为97%。

【关键词】  库蚊属； 基因cecropin; 基因顺序

　　［Abstract］Objective: To clone and analyze the sequence of cecropin gene of Culex quinquefasciatus. Methods: Genomic DNA of C. quinquefasciatus adults was isolated, and was used as template to clone cecropin gene by PCR with a pair of designed primers ATGAACTTCAACAAGCTTT and CAAGTCCTACT TTCCAAGT. The obtained sequence was analyzed with bioinformatics softwares.Results: A cecropin gene of C. quinquefasciatus was obtained, and was sequenced and analyzed. The results showed that the gene was 259 bp and was 97% consistent with that of cecropin gene of C. pipiens. Conclusion: The cloning is successful, and one of the cecropin genes of C. quinquefasciatus was obtained.

　　［Key words］Culex; gene cecropin; gene order
   
　　Cecropins最早是由瑞典家Boman等[1]首先从天蚕蛹中发现的，通过向惜古比天蚕(Hyalophorace cropia)体内注射蜡状芽孢杆菌，可诱导产生抗菌肽(Cecropins)。Cecropins是强碱性蛋白，具有分子量小，水溶性好、不易被酶水解等特点，同时还具有强而广的抗菌、抗癌、抗病毒能力，且对真核细胞无损伤[2]。当前，由于传统抗生素的长期使用，不少病原菌对已有抗生素逐渐产生抗药性，而Cecropins由于其具有特有的抗菌机制和广谱抗菌等特点有可能在医药领域得到广泛应用。致倦库蚊是我国疟疾传播的重要媒介[3]，目前有关致倦库蚊的Cecropins基因研究尚未见报道。2006年克隆了致倦库蚊的Cecropins基因，并对其基因序列及二级结构进行分析。

　　1  材料与方法

　　1.1  蚊种及来源  

　　致倦库蚊（Culex. quinquefascitatus）为贵阳医学院生物学教研室长期繁殖、饲养的贵阳本地株。

　　1.2  主要试剂  

　　TaqDNA聚合酶、PMD 18-T载体试剂盒购自大连TaKaRa生物公司，100 bp DNA Ladder Marker来自天为时代，裂解液(25 mmol/L NaCl、25 mmol/L EDTA、1%SDS、25 mol/L pH7.5 Tris-HCl)、琼脂糖凝胶回收试剂盒V3.0为道普生物公司产品，蛋白酶K购自Promega公司，DP103质粒小提试剂盒购自恒因生物公司。

　　1.3  实验方法

　　1.3.1  引物设计 

　　通过对Genbank中Cecropin基因序列的保守区进行分析,用Primer 5.0软件设计出一对特异引物,上游引物P1:ATGAACTTCAACAAGCTTT，下游引物P2:C AAGTCCTACT TTCCAAGT。

　　1.3.2  DNA提取 

　　取单只3~5日龄蚊置于1.5 ml塑料离心管中，加入裂解液100 μl，用玻璃小研棒研磨，直至看不到明显块状物，加入2.5 μl蛋白酶K溶液(20 g/L),55 ℃水浴消化1 h以上，用等体积的水饱和酚(pH8.0)和氯仿-异戊醇(24∶1)各抽提1次;加入0.2倍体积的乙酸铵溶液(10 mol/L)和两倍体积的无水乙醇, -20 ℃沉淀2 h以上,8 000 r/min离心10 min,沉淀用(4 ℃)预冷的75%乙醇洗涤后离心,沉淀晾干后溶于50 μl双蒸灭菌水中, -20 ℃保存备用。

　　1.3.3  Cecropins基因PCR扩增 

　　反应总体积50 μl，其中含：10×PCR缓冲液5 μl，2.5 mmol/L MgCl2 5 μl，0.2 mmol/L dNTPs 2 μl，引物P5和P6（10 μmol/L）各1 μl，Taq DNA聚合酶0.5 μl，模板DNA量为2 μl（单蚊基因组DNA总量的1/50），无菌水补满反应体系至50 μl。反应条件为：95 ℃ 5 min，→30循环（94 ℃ 1 min→51 ℃ 1 min→72 ℃ 1min）→72 ℃ 延伸8 min。

　　1.3.4  连接、转化、克隆和测序 

　　使用琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒V3.0纯化PCR产物。把纯化回收的Cecropins基因扩增片段与PMD18-T克隆载体相连,转化宿主菌（大肠杆菌DH5α菌）。用DP103质粒小提试剂盒从宿主菌中抽提质粒，分别取2 μl 重组质粒DNA为模板，进行PCR反应，反应体系及扩增条件同前，并用凝胶成像系统照相记录。挑取PCR鉴定阳性的重组单克隆，分别接种于3 ml含Amp的液体培养基中，经37 ℃ 200 r/min摇菌13 h后，大连TaKaRa生物公司进行DNA序列测定。

　　2  结果

　　2.1  PCR扩增和重组质粒鉴定  

　　以致倦库蚊基因组为模板，使用引物P1、P2进行PCR扩增，2.0%琼脂糖凝胶电泳显示得到一条约为280 bp的特异条带（图1A）。以重组质粒为模板, P1和P2为引物进行PCR反应,扩增片段与克隆片段长度相符(图1B)。

　　2.2  测序结果及序列分析    

　　通过PCR方法从致倦库蚊（贵阳株）基因组中扩增出Cecropins基因片段，经克隆测序结果显示片段长度为259 bp。经Blast在线同源性搜索比对显示，测得的致倦库蚊Cecropins基因片段与尖音库蚊CecropinA 基因Score值为316，相似性为97%，具有较高同源性，见图2。利用Compute pI/Mw软件分析目的基因编码蛋白的理论等电点为pI∶5.37，理论分子量为 Mw：14 703.25。SOPMA软件分析表明，其蛋白二级结构中，α螺旋占77.97%，β-转角占5.08%。

　　2.3  Cecropins基因推导氨基酸序列分析  

　　将得到的核苷酸序列递交到NCBI网站,用Blastx软件做同源分析,选取数据库中防御素全长氨基酸序列比较（图3），表明致倦库蚊基因组扩增的目的片段具有Cecropins家族保守结构区域，其N端前18个氨基酸为信号肽序列。

　　2.4  致倦库蚊Cecropin二级结构预测　　

　　利用DNAstar机软件对致倦库蚊Cecropins基因推导的成熟肽区域第21~35位及第38~47位的氨基酸走向作出轮状图，分别分析其疏水和亲水性质。图4显示成熟肽区域第21~35位氨基酸α螺旋的1（Ala）、5（Gly）、9（Phe）、13（Leu）、6（Leu）、10（Gly）、3（Ala）为疏水性氨基酸，分布于轮图中α螺旋下方；7（Lys）、8（Lys）、11（Lys）为亲水性氨基酸，分布于轮图中α螺旋上方。图5显示成熟肽区域第38~47位的氨基酸的6（Ala）、10（Ala）、3（Val）、4（Phe）为疏水性氨基酸，分布于轮图中α螺旋右侧偏上区域；2（Arg）、1（Lys）、5（Lys）、9（Lys）为亲水性氨基酸，分布于α螺旋左侧偏下区域。

　　3  讨论　　

　　本研究采用PCR方法从致倦库蚊（贵阳株）基因组中扩增获得长度为259 bp的 Cecropins基因片段，经Blast比对与尖音库蚊Cecropin A 基因Score值为316，相似性为97%，具有较高同源性。研究表明，不同蚊类Cecropins基因的序列相似程度与分类位置的远近有一定的平行关系，同一属的蚊虫，如伊蚊属的埃及伊蚊和白纹伊蚊，其防御素基因序列的同源性非常高（98%）；不同属的蚊虫，如按蚊与伊蚊的防御素基因的同源性相差较大（58%）[4]。致倦库蚊在基础分类上隶属于尖音库蚊的一个亚种[5]，其Cecropins基因序列比对显示同源性为97%，与其分类关系相符。　　研究表明Cecropins缺乏半胱酸残基,它由两个α螺旋借助一个β螺旋相连而成。β螺旋的结构与位置在决定肽的活性方面,是非常重要的[6]。通过DNAstar计算机软件推导的致倦库蚊Cecropins二级结构与上述结论基本相符。如图5显示成熟肽区域疏水性氨基酸分布于轮图中α螺旋右侧偏上区域，亲水性氨基酸分布于α螺旋左侧偏下区域，这样的分布可使形成的α螺旋具有亲水、亲脂的两亲性，而且α螺旋的亲水侧区域都以碱性氨基酸为主，推测应与Cecropins基因的杀菌机理相关。分析表明，β-转角位于成熟肽21~35位点与38~47位点的两个α螺旋之间，推测该转角与Cecropins活性中心的形成有关。昆虫Cecropins是最早发现的抗菌肽类[7]，具有很强广谱抗菌活性，本实验获得的致倦库蚊Cecropins基因在一级和二级结构上都与其它昆虫Cecropins相似，推测其在蚊体内具有相同的生物学功能，即具有广谱抗菌作用。Cecropins基因抗菌肽的抗菌机制独特，类似Cecropins基因的抗菌肽类物质在人类疾病防治方面有广泛的应用前景。目前，美国Xoma公司利用真核表达载体转染CHO细胞表达的重组杀菌蛋白rBPI21(商品名为Neuprex)，具有BPI21天然的生物学活性，现已进入临床试验[8]。但是，抗菌肽类（如Cecropins基因）的分子量小，分离提纯存在一定的困难，天然资源有限，通过生物合成技术提高产量则成本较高，这些均需从抗菌肽结构和活性关系、作用机理及基因表达等方面作进一步的研究。

【】
  　　[1]Boman HG, Ingrid Nilsson Faye, Kerstin Paul, et al . Charcteristics of an inducible cell-free antibacterial reation in hemolymph of samia Cynthia pupae[J].Infect Immun,1974（10）:136-145.

　　[2]Kokoza V, Ahmed A ,Cho W L, et al. Engineering blood mealactivated systiced syste mic immunity in the yellow fever mosquito ,aedes aegypti[J].Pro Natl Acad Sci USA,2000 (16):9144-9149.

　　[3]吴观陵.人体寄生虫学[M].3版.北京:人民卫生出版社，2005：25-29.

　　[4]支国舟，陈晓光，周晓红. 蚊防御素基因的克隆及序列分析[J].第一军医大学学报，2002（6）：499-502.

　　[5]刘先凯,赵彤言. 白纹伊蚊和埃及伊蚊防御素(defensin)成熟肽基因克隆及结构推测[J].寄生虫与医学昆虫学报，2003（1）：30-34.

　　[6]Lowenberger C, Charlet M, Vizioli J, et al. Antimicrobial activity spectrum,cDNA cloning, and mRNA expression of newly isolated member of the cecropin family from the mosquito vector Aedes aegypti[J]. Biol Chem,1999（274）：20092-20097.

　　[7]Lyric C Bartholomay ,Hoda A Farid ,Reda M Ramzy,et al.Culex pipiens pipiens: characterization of immune peptides and the influence of immune activation on development of Wuchereria bancrofti[J].Molecular & Biochemical Parasitology,2003 (130):43-50.

　　[8]Ravi K Rauniyar, Kiyoshi Suzuma, Adam L King, et al. Differential effects of bactericidal permeability-increasing protein (BPI) analogues on retinal neov-ascularization and retinal pericyte growth [J]. Investigative Ophthalmology & VisualScience,2002(2):503-509.