紫金莲的化学对照品研究
作者：李勇军，何迅， 廖尚高，王爱民，兰燕宇，黄勇，王永林
【摘要】 目的： 建立从紫金莲中制备白花丹醌对照品的方法。方法: 用萃取、低压硅胶柱层析、重结晶等方法对紫金莲乙醇提取物进行分离纯化，通过质谱、核磁其振、薄层色谱及高效液相色谱等方法对其分离产物进行结构鉴定和纯度测定。结果: 制备得到的白花丹醌对照品经薄层色谱检查无杂质，二维和三维高效液相色谱检查为单一成分，纯度在98％以上，符合中药化学对照品含量测定要求。结论: 建立的制备白花丹醌对照品的方法简单,对照品纯度高,可作为紫金莲及其制剂质量研究用化学对照品。
【关键词】 紫金莲； 白花丹醌； 质量控制
［Abstract］ Objective: To establish a method for preparing the reference substance of plumbagin. Methods: Ethanol-extract of Radix Ceratostigmae was isolated and purified by combining solvent extraction with column chromatography and recrystallization methods. Plumbagin was identified by mass spectrometry (MS)and nuclear magnetic resonance (NMR).Purity of the products was determined by TLC and HPLC. Results: The purity of plumbagin was over 98%. Conclusion: This method is simple and effective to produce products with high purity, and the product can be used as reference in the quality control of Radix Ceratostigmae and its preparation.
［Key words］ Radix Ceratostigmae; plumbagin; quality control
紫金莲为兰雪科植物紫金莲 (Ceratostigma willmottianum Stapf)的干燥根，具有活血止痛，通经活络，化瘀散结的功效，用于跌扑骨折，风湿麻木，扭伤等[1]。目前对紫金莲药材的质量控制方法仅有性状和理化鉴别[1]，难以真正体现和保障其内在品质，为了更好地保证和评价紫金莲质量，通过对该药材的成分研究，发现白花丹醌是紫金莲药材的主要成分。国内外的药理研究表明，紫金莲中的白花丹醌具有抗菌、祛痰、抗生育等多种活性[2]。为了便于紫金莲药材及其制剂的质量研究，2007年6月~12月有关[3~5]，对白花丹醌对照品的制备进行了研究，报告如下。
1 仪器与试药
VarianINOVA-400核磁共振波谱仪；HP5973-MSD质谱仪；美国安捷伦科技公司Agilent 1100高效液相色谱仪系列，含四元低压梯度系统、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、阵列二极管检测器（DAD）及ChemStation B01.03色谱工作站；日本岛津UV-2401PC紫外-可见光分光光度计，色谱用硅胶（200～300目）及硅胶G预制板由青岛海洋化工厂生产。乙腈(色谱纯)、甲醇（色谱纯）、磷酸（分析纯），水为二次蒸馏水，其它试剂均为分析纯。实验样品采自贵州省织金县，由贵阳医学院龙庆德老师鉴定为Ceratostigma willmottianum Stapf.。
2 方法与结果
2.1 药材提取与分离紫金莲药材粗粉1.5 kg，用3倍量乙醇回流提取2次，每次1.5 h，过滤，滤液减压回收乙醇至750 ml，加水750 ml混匀，用氯仿萃取3次，每次300 ml，合并氯仿，减压回收氯仿得浸膏13 g。
2.2 化合物分离13 g浸膏用少量丙酮溶解，加30 g硅胶(200~300目)拌样，晾干，研细，备用；取硅胶(200~300目) 300 g，用石油醚（30~60 ℃）湿法装柱；将拌样硅胶上于装好硅胶柱表面，用石油醚（30~60 ℃）∶醋酸乙酯 (9.5∶0.5) 洗脱，分段收集；各段在硅胶G预制板上点样，用石油醚（30~60 ℃）∶醋酸乙酯 (9∶1)展开，检查合并Rf =0.5的桔黄色主斑点部分，回收溶剂，残留物用10 g硅胶拌样，上于200 g硅胶(200~300目)柱上，用石油醚（30~60 ℃）∶氯仿(8∶2) 洗脱，分段收集；各段在硅胶G预制板上点样，用石油醚（30~60 ℃）∶氯仿 (6∶4)展开，检查合并Rf =0.5的桔黄色主斑点部分，回收溶剂，残留物用适量氯仿溶解放置结晶，滤出结晶，得黄色颗粒结晶2.5 g。
2.3 结构确定白花丹醌呈桔黄色针晶；熔点78.5~79.5 ℃；UVλmax（MeOH）：209.5、264.5、415.0 nm；EI-MS m/z：188(M+,100),173,160,145,131,120,103；IR(KBr)cm-1： 1 664,1 645(C=O),1 609,1 455(Ar),1 365,1 259,1 231,1 161,1 028,902,836,752；1H-NMR(CDCl3)δ：2.27（3H,d,J=0.8 Hz,2-CH3）,6.80（1H,d,J=0.8 Hz, 3-H）,7.26(1H,dd,J=2.0, 7.6 Hz 6- H),7.60(2H,m, 7,8- H)；13C-NMR(CDCl3)：16.5(2-CH3),115.0(C-4a)119.3(C-8),124.1(C-6),132.0 (C-8a), 135.4(C-3), 136.1(C-7), 149.6(C-2), 161.1(C-5), 184.7(C-1),190.2(C-4)。以上数据与文献[2,6,7]报道的一致，确定该化合物为白花丹醌，结构式见图1。
2.4.1 杂质检查
取白花丹醌加甲醇制成1 g/L样品溶液，条带状点于硅胶GF254薄层板上，点样量10 μl、20 μl；展开剂：石油醚（60~90℃）∶乙酸乙酯（9∶1）；正己烷∶丙酮（9.5∶0.5），石油醚（60~90℃）∶氯仿（8∶2）；色谱识别：紫外光（254 nm）灯下和10%硫酸乙醇加热后检视；在薄层板上经3个展开系统两种显色方式检识均呈单一斑点，色谱中不显杂质斑点。
2.4.2 峰面积归一化法纯度检查
Hypersil C18色谱柱(200 mm×5.0 mm，5 μm) 以乙腈为流动相A, 0.1%磷酸为流动相B，按表1中的规定进行洗脱；用DAD检测器在230、254、270、329、360 nm测定，各波长下的峰面积按归一化法，结果白花丹醌对照品在各波长下测定的含量均大于98%，结果见表2、图2。表2 白花丹醌各波长的测定结果（略）
3 讨论
从紫金莲中提取白花丹醌在回收乙醇过程中，发现使用低浓度乙醇时，白花丹醌可随溶剂蒸馏出部分，造成损失，于是在回收到1 ml含2 g生药时停止回收，加一倍水，用氯仿提取富集白花丹醌进行下一步分离。在稳定性研究中发现，白花丹醌在光照高湿条件下稳定，但有升华性，因此白花丹醌需要密闭低温保存。白花丹醌为紫金莲的活性成分，含量较高，性质稳定，用上述制备方法进行提取、分离、纯化，操作方便，重现性好，制备的白花丹醌符合对照品的要求，可作为紫金莲及其制剂质量研究时的化学对照品。
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