两种提取家蝇幼虫血淋巴方法的比较
【摘要】 目的： 对剪头法和瞬时破壁法提取的家蝇幼虫血淋巴粗提液进行蛋白浓度和SDS-PAGE分析比较。方法： 分别采用剪头法和瞬时破壁法提取家蝇幼虫血淋巴粗提液，同时设立未诱导组和热诱导组，测定各组的蛋白浓度进行比较分析，并对各组血淋巴粗提液进行SDS-PAGE的分析比较。结果： 剪头法热诱导组的血淋巴粗提液蛋白浓度高于未诱导组，瞬时破壁法提取的血淋巴粗提液蛋白浓度高于剪头法；经SDS-PAGE分析，瞬时破壁法提取的血淋巴粗提液蛋白条带明显多于剪头法。结论： 瞬时破壁法提取家蝇幼虫血淋巴简便易行，所提取的血淋巴蛋白成分多于剪头法。
【关键词】 家蝇； 幼虫； 血淋巴
［Abstract］ Objective: To compare two methods for collecting hemolymph of housefly larvae. Methods: Two methods, beheading and transient bodywall breaking down (TBB), were compared by comparing the total hemolymph volume, protein concentration and protein bands on SDS-PAGE jell of collections respectively by the two methods. Housefly larvae in two states: heat induced and non-induced were used in each method experiment. Results: The hemolymph protein concentration of heat-induced larvae collected by beheading was higher than that of non-induced larvae; The hemolymph protein concentration collected by TBB method was higher than that collected by beheading method; The bands on SDS-PAGE jell of hemolymph collected by TBB method were more than those collected by beheading method. Conclusion: TBB method is more simple and convenient for collecting the housefly larvae hemolymph, and the hemolymph protein ingredients are richer than those collected by beheading method.
［Key words］ houseflies; larvae ; hemolymph
家蝇（Musca domestica）是一种重要的医学昆虫，在人工大规模高密度饲养条件下，也很少集体染病，具有较高地免疫防御机制，国内外学者已从家蝇幼虫的血淋巴中分离到多种抗细菌肽和抗真菌肽等活性肽类物质[1~5]。目前对家蝇幼虫血淋巴的提取收集主要有剪头法、研磨法、匀浆法等，后两种方法提取的成分更近似于家蝇幼虫的匀浆液。本研究采用沸水瞬时处死幼虫后再瞬时离心，即瞬时破壁法，提取液更接近血淋巴成分，操作也比剪头法简便易行。为探讨瞬时破壁法提取血淋巴的优缺点，采用剪头法和瞬时破壁法提取家蝇幼虫血淋巴，并设立未诱导组和热诱导组，对所提取制备的的血淋巴粗提液进行分析比较，报告如下。1 材料与方法
1.1 家蝇来源及饲养驯化家蝇由本院寄生虫学教研室2000年建立种群，由本实验室饲养传代，幼虫按常规方法饲养至3龄（孵化后第4天）备用。
1.2 试剂
BCA蛋白检测试剂盒是美国Pierce公司产品，丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Tris、Tricine、过硫酸铵是AMRESCO公司产品，TEMED是Sigma公司产品，SDS是Sino-American Biotechnology公司产品，肽类分子量标准是安玛西亚公司产品，蛋白质分子量标准由上海生物化学研究所生产，其他试剂均为国产分析纯。实验用水均为Millipore超纯水。
1.3 仪器
Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司），电泳仪、电泳槽（北京六一厂），5415 R冷冻离心机（德国Eppendorf公司）。
1.4 方法
1.4.1 家蝇幼虫的准备
分为未诱导组和热诱导组。未诱导组即3龄家蝇幼虫；热诱导组取3龄家蝇幼虫置于65 ℃电热恒温箱中1 min，再于室温下静置5 min，重复3次；最后置于65 ℃诱导5 min，取出后将幼虫放入饲料中继续饲养24 h后备用[6]。
1.4.2 家蝇幼虫血淋巴粗提液的制备
（1）剪头法：取准备好的家蝇幼虫洗净后，用滤纸将体表水分蘸干，剪掉头部，收集血淋巴原液于冰浴中的Eppendorf管中；用4 ℃ Millipore超纯水将血淋巴原液稀释10倍，沸水浴5 min，冷却后于冷冻离心机4 ℃ 12 000 r/min离心30 min，取上清液作为血淋巴粗提液。（2）瞬时破壁法：取30 g家蝇幼虫洗净后，用沸水瞬时处死幼虫，滤纸蘸干体表水分；将幼虫与50 ml 4 ℃ Millipore超纯水混合，倒入搅拌机中搅拌5 s，于冷冻离心机4 ℃ 12 000 r/min离心30 min，取上清液沸水浴10 min，再次离心取上清作为血淋巴粗提液。
1.4.3 家蝇幼虫血淋巴粗提液蛋白浓度测定
取制备的各组家蝇幼虫血淋巴粗提液25 μl，加入200 μl BCA蛋白检测试剂盒工作液，37 ℃培养30 min后测定OD值（562 nm），从标准曲线蛋白质浓度。
1.4.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
采用Tris-Tricine SDS-PAGE体系[7]，样品胶浓度为10％，成层胶浓度为4％，分离胶浓度为16％。分别取各组家蝇幼虫血淋巴粗提液20 μl（1.65mg/ml）与20 μl样品缓冲液均匀混合后，沸水浴5 min，冷却至室温后上样，90 V恒压电泳至指示剂进入分离胶后，120 V恒压电泳至胶底时结束电泳，考马斯亮蓝R-250染色。
1.5 数据统计与分析
使用SPSS11.0统计学软件，各组数据以(x±s)表示，两组均数的比较采用t检验。
2 结果
2.1 两种提取方法工作效率剪头法提取家蝇幼虫血淋巴并制备为粗提液，平均约需处理30只幼虫（0.03 g/只）可制得1 ml血淋巴粗提液，工作4 h约可处理300只（9 g）幼虫，制得血淋巴粗提液10 ml;瞬时破壁法，工作4 h可处理30 g幼虫，制得血淋巴粗提液43 ml。
2.2 蛋白浓度剪头法提取的家蝇幼虫血淋巴粗提液，热诱导组的蛋白浓度明显增高，与未诱导组相比差异具有统计学意义（P＜0.01）。瞬时破壁法提取的家蝇幼虫血淋巴粗提液，热诱导组的蛋白浓度与未诱导组相比没有增高，两者相比差异没有统计学意义（P＞0.05）。瞬时破壁法提取的家蝇幼虫血淋巴粗提液蛋白浓度明显高于剪头法提取的粗提液蛋白浓度，各组相比差异具有统计学意义（（P＜0.01）。见表1。表1 家蝇幼虫血淋巴粗提液的蛋白浓度（略）注：(1)与剪头法未诱导组比较，P＜0.01，(2)与剪头法热诱导组比较，P＜0.01。
2.3 SDS-PAGE结果剪头法提取的家蝇幼虫血淋巴粗提液，经SDS-PAGE分析，在66.2 kDa和97.4 kDa间有部分蛋白条带，主要蛋白组分集中在6.210 kDa与20.1 kDa之间。未诱导组与热诱导组的血淋巴粗提液显示的条带数基本相同，尚不能从图中观察到两组间的明显差异。瞬时破壁法提取的家蝇幼虫血淋巴粗提液，经SDS-PAGE分析，主要蛋白组分集中在43.0 kDa以下，蛋白条带数明显多于剪头法，未诱导组与热诱导组的血淋巴粗提液显示的条带数基本相同，并不能从图中观察到两组间的明显差异。见图1。
3 讨论
目前，国内外学者已从家蝇幼虫的血淋巴中分离到多种抗菌肽并进行后续的研究，同时，亦努力从其血淋巴中分离到更多的抗真菌肽、抗病毒肽等活性肽类物质，而家蝇幼虫血淋巴的收集和提取是研究工作的第一步。顾丽娟[8]、张勇[9]和高松[6]将家蝇幼虫洗净后，剪去幼虫头部收集血淋巴原液，并将其稀释后沸水浴数分钟，离心取上清液制备为粗提液，此即为剪头法。这种方法需将幼虫逐条剪去头部，一般要剪取数10条幼虫才能收集到100 μl血淋巴原液，提取效率较低，技术要求也较高，且血淋巴原液在操作过程中常因酶的作用而氧化变黑。剪头法与研磨法、匀浆法[10]等所提取的粗提液相比，其成分简单，方便后续的分离纯化。为了解决提取家蝇幼虫血淋巴时效率与纯度的矛盾，本实验创新采用了瞬时破壁法，用沸水将幼虫瞬间处死，然后与少许水混合后用搅拌机瞬时搅拌以不完全破坏虫体，将上清液取出沸水浴数分钟，再离心取上清液制备为粗提液。结果表明，瞬时破壁法的提取效率明显高于剪头法，不但操作简便，且幼虫在粗提前经沸水处理，其中的酶已变性失活，使提取的血淋巴在后续处理过程中不会出现氧化变黑及损坏靶分子的现象。另外，采用瞬时破壁法每操作一次可收集大量血淋巴粗提液，且因虫体组织细胞未被破坏，所以用此法所收集的血淋巴成分理论上应不包含组织细胞成分，有利于对血淋巴的定向研究。此外，实验结果显示，瞬时破壁法提取的血淋巴粗提液蛋白浓度明显高于剪头法，经SDS-PAGE分析所得蛋白条带也较多，可见其成分比剪头法所得血淋巴粗提液的成分多，这有利于在初步分离纯化时筛选到较多的活性成分。
本研究中，用两种方法提取家蝇幼虫血淋巴的同时，还设立了未诱导组和热诱导组。研究发现，多种诱导方法能使家蝇幼虫体内的抗菌肽、抗真菌肽等的表达量提高，或产生一些新的诱导性的活性肽类物质[11]。这些诱导方法中，热诱导的方式具有幼虫诱导量大、诱导时间短、诱导后幼虫成活率高、操作方便等较多的优点[6]。实验结果表明，剪头法热诱导组的血淋巴粗提液蛋白浓度明显高于未诱导组，可见，经热诱导后，家蝇幼虫血淋巴中的蛋白或肽类物质确实有所增加，具体是某些活性肽类物质量的增加还是产生了新的活性肽类物质，尚需进一步的研究。另外，瞬时破壁法热诱导组与未诱导组血淋巴粗提液蛋白浓度无明显差别，但其中活性成分的量及生物活性是否也无差别，仍需继续研究。总之，瞬时破壁法提取的家蝇幼虫血淋巴粗提液虽然成分较剪头法略复杂，但有利于在后续分离纯化中获得更多的活性成分，且操作简便，提取效率高，不失为提取方法的一种新选择。本研究下一步将对两种提取方法获得的家蝇幼虫血淋巴粗提液进行后续分离纯化，并分析这些成分的生物活性，以进一步探讨家蝇高效的免疫防御机制。
【】
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