灵芝三萜类化合物对AD模型大鼠脑组织保护作用的研究
作者：黄勇攀，刘丙进，喻南慧，刘鲜林，孔祥林，罗俊
【摘要】 目的： 观察灵芝三萜类化合物（GLT）对AD模型大鼠海马组织形态的影响。方法： 70只大鼠随机分为生理盐水组，假手术组，模型组，溶媒组，GLT低、中、高剂量组；除生理盐水组和假手术组外，其余各组大鼠单侧海马内一次性注射Aβ25-35制作AD大鼠模型，术后生理盐水组、假手术组、模型组大鼠分别灌胃生理盐水，溶媒组灌胃食用油，GLT各组分别灌胃低、中、高剂量的GLT20 d，然后采用透射电镜观察海马神经元的超微结构变化。结果： GLT能明显改善模型大鼠脑组织海马CA1区神经元的退行性变化。结论： GLT能改善大鼠海马CA1区神经元的退行性变化。
【关键词】 灵芝属； 阿尔茨海默病； 海马； 丙二醛； 显微镜检查，，扫锚透射； 大鼠，Sprague-Dawley
［Abstract］Objective: To observe the protective effects of triterpenoids from Ganoderma lucidum (GLT) on the modality of hippocampus tissue of Alzheimer disease (AD) model rats．Methods: AD rats induced by injection of Aβ25-35 into one side of hippocampus were treated with GLT orally for 20 days and then ultrastructural changes of neurons were observed under transmission electron microscope．Results： The modality of hippocampus CA1 region neurons of GLT treated AD rats was distinctly improved when compared with that of the model rats that did not receive GLT treatment．Conclusion: GLT can improve recessively changed neurons in hippocampus CA1 region．
［Key words］ Gardenia; Alzheimer disease; hippocampus; malondialdehyde; microscopy,electron，scaning transmission; rats,sprague-dawley
阿尔茨海默病(Alzheimer disease ,AD) 是一种渐进性神经退行性疾病，其病理改变为大脑皮质萎缩,皮质神经元减少,大脑皮质和海马中可见大量神经元纤维缠结(NFT)和老年斑(SP)，即脂褐素。AD临床表现为近期记忆力降低,继而表现持续性智能衰退、运动障碍等。据研究发现脑内胆碱能传递功能紊乱、自由基损伤、β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积、神经元凋亡等因素可能在AD的发病机制中起关键性作用。Aβ沉积是AD发病过程中的关键性因素之一已基本得到了公认。GLT存在于赤芝子实体和孢子粉中，有抗氧化、抗衰老等药理作用[1]，本实验采用形态学方法，探讨GLT对Aβ25-35所致AD大鼠的防治作用及机制，为临床AD提供依据。
1 材料和方法
1．1 实验材料
SD大鼠，雄性，体重（280±20）g由贵阳医学院实验动物中心提供，合格证号SCXK（黔）2002-50001。Aβ25-35（β-5amyloid25-35）购自Sigma公司；DYT2E脑立体定位仪购自天津医疗器械研究所。灵芝三萜类化合物（GLT，由中科院地球化学所提供）用食用油配制成相应浓度，常温保存。健脑胶囊是青岛国风药业股份有限公司产品。
1．2 方法
70只大鼠随机分为7组，生理盐水组(生理盐水10 ml/kg)、假手术组(生理盐水10 ml/kg)、模型组(生理盐水10 ml/kg)、GLT低、中、高剂量组（0.25 g/kg、0.5 g/kg、1.0 g/kg)，溶媒组（食用油10 ml/kg）。 Sharma等[2]的方法，大鼠经 10％水合氯醛(0.3 g/kg) 腹腔注射麻醉后固定于大鼠脑立体定位仪上，侧脑室注射进针坐标为：前囟后3.5mm，中线左侧2 mm，自颅骨表面深3 mm。除假手术组和生理盐水组外，其余各组动物均微量注射2 μl Aβ25-35缓慢注入，留针5 min；生理盐水组注入等体积无菌生理盐水，假手术组钻开颅骨后即缝合伤口。各组动物术后常规注射阿奇霉素连续3 d。术后次日按上述剂量灌胃给药，每日1次,连续20 d。
1．3 大鼠海马CAI区锥体细胞超微结构
实验结束后取大鼠，切开皮肤，钝性分离，找到双侧的颈总动脉，一侧插管，一侧结扎，并剪开一侧的颈外静脉以利于回流，先灌注生理盐水，再灌注戊二醛固定液，固定1 h后取脑。取海马CA1区组织1 mm3，1％锇酸后固定，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀、枸橼酸铅染色，H-600型透射电镜观察、摄片。对切片海马CA1区随机选取若干铜网观察，每只铜网在海马CA1区锥体细胞区域摄片[3]。
2 结果
透射电镜下，模型组及溶媒组海马CA1区锥体细胞核膜局部肿胀内质网扩张，核周质线粒体肿胀，大部分嵴消失，粗面内质网颗粒消失，可见脂褐素，有NFT，颗粒空泡变性，核染色质边聚（图1、2、3）。生理盐水组和假手术组锥体细胞胞浆内可见丰富的线粒体、粗面内质网及高尔基体等细胞器（图4）。GLT组锥体细胞线粒体轻度肿胀，内质网轻度扩张，细胞核轻度固缩，核膜清晰。胞质内见较多的线粒体、核糖体及粗面内质网，少量NFT，细胞器尚属正常（图5、6）。
3 讨论
AD是中枢神经系统一种常见的进行性神经退行性疾病，其临床表现为进行性记忆力减退，认知能力下降等，其主要病理改变是神经细胞之间存在大量的SP以及神经细胞内存在大量的NFT。海马内注入Aβ25-35造成AD模型大鼠，其学习记忆变化及病理变化贴近AD[4]。本实验依此为基础，进一步研究灵芝三萜类化合物对AD的防治作用。 灵芝是我国传统的延年益寿中药，中医理论认为，灵芝具有“益精气，补五脏，滋补强壮，扶正固本”的作用[5]。药研究证明，灵芝提取物灵芝三萜类化合物有抗氧化、延缓衰老、清除自由基等药理作用，因而使用GLT对阿尔茨海默病的能改善大鼠海马锥体细胞超微结构变化，减少脂褐素堆积，发挥其保护神经细胞的抗氧化作用[6,7]。本实验通过对大鼠单侧侧脑室注射Aβ25-35，大鼠活动量及食量同时减少，皮毛无光泽，水迷宫训练学习记忆能力下降,说明AD模型成功。电镜结果显示，Aβ在大脑内能引起海马锥体细胞的退行性改变及早期凋亡现象，如细胞水肿，细胞核中异染色质呈边集现象，核膜断裂，核间隙增宽，细胞器破坏，结构显示不清，髓鞘水肿排列紊乱，颗粒空泡变性及NFT。氧自由基对神经元超微结构的损害必然导致神经元功能降低，可以表现为胞核和粗面内质网损害，导致蛋白合成机能下降；线粒体受损导致能量代谢障碍；大量增多的脂褐素堆积干扰细胞器几何空间，使得神经元有序性破坏，从而致使神经元衰老死亡。使用GLT后，AD大鼠海马锥体细胞NFT、颗粒空泡变性较前明显改善，细胞水肿减轻，线粒体、高尔基体、核糖体较模型组明显增多，这正好与GLT能改善AD神经元结构的退变相吻合。表明GLT对海马锥体细胞的超微结构退变有明显的改善作用。
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