灵芝三萜类化合物对AD模型大鼠脑组织中CAT,ACHE,SOD,MDA的影响
【摘要】 目的： 探讨灵芝三萜类化合物（GLT）对阿尔茨海默病(AD)的防治作用，为临床新药的开发和应用提供理论依据。方法: 将经Morris水迷宫筛选合格的SD大鼠80只分为8组，正常对照组、假手术组,模型组、GLT低、中、高（GLT 0.25 、0.5、1.0 g/kg) 剂量组 、阳性药组（健脑胶囊组0.54 g/kg）和溶媒组（食用油10 ml/kg）,除正常对照组和假手术组外，其余各组大鼠经侧脑室注射Aβ25-352 μl制备AD大鼠模型，正常对照组侧脑室注射等量生理盐水，术后次日开始灌胃给药。每天1次，连续给药20 d后，处死动物取脑组织制备匀浆。采用光化学法检测脑匀浆中过氧化氢酶（CAT）、乙酰胆碱酯酶（ACHE）、超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量。结果: 与正常对照组比较，模型组脑组织中CAT活性降低，ACHE活性升高，SOD活性降低，MDA含量升高。与模型组比较，三个GLT给药组脑组织中，CAT活力均升高，ACHE活力均下降，SOD活性均升高，MDA含量均降低。结论: 灵芝三萜类化合物对AD模型大鼠具有增强清除自由基的能力，抗脂质过氧化及促进胆碱能神经系统功能的恢复。
【关键词】 阿尔茨海默病； 灵芝属； 脑； 过氧化氢酶； 乙酰胆碱脂酶；
［Abstract］ Objective: To investigate the preventive effects of ganodermo lucidum triterpenoids (GLT) to Alzheimer disease（AD）in model rats. so as to provide theory basis for new drug exploitation and clinical application. Methods: Eighty SD rats chosen by Morris water maze test were randomly divided into 8 groups: normal control group ( group NC, received 10 ml/kg of distilled water), sham operation group (group SO, received 10 ml/kg of distilled water), model group (group M, received 10ml/kg of distilled water), GLT treated groups (group G1, received 0.25 g/kg of GLT; group G2, 0.50 g/kg, and group 3, 1.0 g/kg), masculine drug group (group MD, received 0.54 g/kg of Jiannao capsules)，and solute mediated group (group SM, received 10 ml/kg of edible oil). All of the SD rats except those in group NC and group SO were microinjected with beta-amyloid peptide segment 25-35 (Aβ25-35) into lateral ventricle to produce AD model, and instead, rats in group NC were injected with saline. GLT treatment began on the next day, once a day intragastrically for 20 days. Then, the animals were executed, and the brain tissues were taken out and blended for the tests of activities of catalase (CAT) , acetyl cholinesterase (ACHE), superoxide dismutase (SOD), and the content of malondialdehyde (MDA) with chemistry detecting kits. Results: The activities of CAT, SOD were lower, while ACHE activity and MDA content were higher in rats of group M than those in group NC; The activities of CAT, SOD were higher, while ACHE activity and MDA content were lower in GLT groups than those in group M. Conclusion: The GLT has ability of strengthening the cleaning of free radicals in Aβ25-35 toxicated rats, and ability of anti-liqid-peroxidation, and can promote the restore of choline nervous system function.
［Key words］ Alzheimer disease；Ganoderma; brain; catalase; acetylcholinesterase; superoxide dismutase; malondialdehyde; rat, sprague-dawley
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是以进行性痴呆为主要症状，以认知能力迅速减退和记忆功能丧失为特征的大脑变性疾病，其病理特征主要有老年斑(SP)、神经纤维缠结(NFT)和神经元丢失等病理改变[1]。随着人类平均寿命的延长,世界人口趋于老龄化，AD的发病率也逐渐提高，现已成为威胁人类健康的社会问题之一,预防和AD已成为一个重要的医学课题。目前，AD的病因不明确，从根本上治愈尚缺乏理想的方法和药物。2007年10月采用大鼠侧脑室注射Aβ25-35制备AD大鼠模型，研究不同剂量灵芝三萜类化合物[2]对AD 大鼠脑组织CAT、ACHE、SOD、MDA的影响，以探讨药物对AD模型鼠的作用机制。
1 材料及方法
1.1 材料
1.1.1 动物
雄性健康成年SD大鼠（280±20）g，由贵阳医学院实验动物中心提供。动物合格证（SCXK(黔)2002-0001）。
1.1.2 药品与主要试剂
GLT（院地球化学研究所超临界流体技术研究中心提供)，健脑胶囊(青岛国风药业股份有限公司)，Aβ25-35 (Sigma,USA Lot 114k4773)，CAT、ACHE、SOD及MDA试剂（南京建成生物工程研究所）。
1.1.3 主要仪器
DYT2E型脑立体定位仪(中国天津医疗器械研究所),XH-B型漩涡混匀器(江堰市康健医疗器具有限公司),80-2型离心沉淀机(上海手术器械厂),-80 ℃超低温冰箱(Forma Scientic ,Germany),721分光光度计(北京光学仪器厂),37 ℃及100 ℃水浴箱(北京长源实验设备厂),550nm紫外分光光度计(北京光学仪器厂)，5810R型台式低温离心机(eppendorf Germany)。
1.2 实验方法
1.2.1 分组、造模及给药
大鼠80只随机分为8组，正常对照组(NS 10 ml/kg)、假手术组(NS 10 ml/kg)、模型组(NS 10 ml/kg)、GLT低、中、高（GLT 0.25、0.5及1.0 g/kg)剂量组，阳性药组（健脑胶囊0.38 g/kg）、溶媒组（食用油10 ml/kg）， Sharma等[3]的方法，所有大鼠经 10％水合氯醛(0.3 g/kg) 腹腔注射麻醉后固定于大鼠脑立体定位仪上，常规消毒皮肤，正中矢状切口，分离骨膜，锥颅器钻开颅骨，暴露硬脑膜。侧脑室注射进针坐标为：前囟后3.5mm，中线左侧2mm，自颅骨表面向下深度3 mm。除假手术组和正常对照组外，其余各组动物均微量注射器垂直进针3 mm，将2 μl Aβ25-35缓慢注入，留针5 min，缝合伤口；正常对照组注入等体积无菌生理盐水，假手术组钻开颅骨后即缝合伤口。各组动物术后常规注射阿奇霉素50 mg/d连续3 d。术后次日按上述剂量灌胃给药，1次/d,连续20 d。实验结束后，大鼠断头剥取脑组织并称重，按1∶9（每克脑组织加9 ml冰生理盐水）的比例制成10%脑组织匀浆（匀浆过程始终处于冰水中）。将组织匀浆分成数份，置于低温离心机离心10 min（4 ℃，3 500r/min），取上清液，-80 ℃冰箱保存备用[4]。
1.2.2 测定指标
测定脑组织中CAT、ACHE、SOD活性及MDA含量，按试剂盒说明书操作。
1.3 统计学处理实验数据以（x±s）表示，采用SPSS12.0统计软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）。
2 结果
2.1 CAT和ACHE活力
灵芝三萜类化合物对AD模型大鼠脑组织中CAT,ACHE,SOD,MDA的影响 见表1。AD模型组大鼠脑组织中CAT活力降低，ACHE活力增强，与正常对照组比较有显著性差异（P＜0.01）；GLT低、中、高剂量组大鼠脑组织中CAT活力均升高，ACHE活力均下降，与AD模型组比较有显著性差异（P＜0.01）。表1 GLT 对Aβ25-35模型大鼠脑组织CAT、ACHE的影响（略）注：与正常对照组比较，(1)P ＜0.01；与模型组组比较，(2)P＜0.01。
2.2 SOD活力和MDA含量见表2。AD模型组大鼠脑组织中SOD活力降低，MDA含量增高，与正常对照组比较有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）；GLT低、中、高剂量组大鼠脑组织中SOD活性均升高，MDA含量均降低，与AD模型组大鼠相比有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。表2 GLT 对Aβ25-35模型大鼠脑组织SOD、MDA的影响（略）注：与正常对照组比较，(1) P ＜0.05，(2)P ＜0.01；与模型组组比较，(3)P＜0.05，(4)P＜0.01。
3 讨论
实验结果表明，GLT能明显提高AD模型大鼠SOD活性、降低MDA含量，提示GLT有提高机体清除自由基及（或）抑制自由基对脑的损害作用，这可能是该药有效防治AD的作用机理之一。同时检测结果显示，模型组大鼠脑组织CAT活性升高，ACHE活性升高；与正常对照组比较，模型组大鼠脑组织中SOD活性下降，MDA含量升高。
AD发病机制不明，目前国内外学者认为与脑内胆碱神经功能紊乱、自由基损伤、Aβ沉积、基因突变等因素有关。Ach由胆碱乙酰化酶合成，通过Ach受体发挥生物效应。ACHE是胆碱能神经系统的重要功能酶，其主要作用是将Ach水解为胆碱和乙酸，从而维持神经系统功能的稳定。ACHE是Ach的降解酶，测定脑组织中ACHE的活性，可间接判断脑内Ach含量的变化[5]，目前许多研究均以ACHE活性作为反映中枢胆碱能神经系统功能状态的重要指标[6，7]。本实验中，模型组ACHE增高，而给GLT后， ACHE活性降低。结果表明，GLT可以对抗Aβ25-35侧脑室注射所致中枢胆碱能神经系统损伤所引起的ACHE活性的升高，恢复胆碱能神经系统的功能。
脑组织是自由基连锁反应和脂质过氧化作用的靶组织，因其对氧的高度依赖性及含有丰富的不饱和脂肪酸，是最容易受氧化损伤的部位。自由基连锁反应主要攻击脑内灰质富含脂质的神经元，导致细胞膜的磷脂破坏、变性，细胞膜的通透性增加，引发神经元中毒性水肿，细胞内酶活性改变，神经递质释放，神经细胞死亡。在探讨自由基损伤实验中，最常见的检测指标为MDA含量及SOD活性。MDA是脂质过氧化物的分解产物，是一种重要的大分子交联剂，其含量在一定程度上反映组织细胞损伤的程度，它能交联大分子物质，使蛋白质变性，DNA发生突变，影响细胞的功能。SOD是自由基清除的关键酶，SOD的升高可减轻缺血缺氧引起的脑损伤。GLT低、中、高剂量连续灌胃给药20 d后,脑组织损伤明显减轻，上述生化指标不同均程度改善。表明GLT连续灌胃给药对Aβ25-35侧脑室内注射所致AD模型大鼠的脑组织有保护作用，能增强大鼠脑组织SOD活性，降低脑组织内MDA含量，从而对抗侧脑室内注射Aβ25-35诱发的氧化应激损伤。
【】
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