大鼠整体低氧预处理减轻肺缺血再灌注损伤

                            作者：李涛，陈莹，李保罗，陆德琴  

【摘要】  　　目的： 探讨低氧预处理（HPC）对肺缺血再灌注 ( I/R) 损伤的保护作用。方法： 重复性低氧5次建立大鼠HPC模型，双活结套扎左侧肺门45 min后再灌注120 min复制肺I/R损伤模型；设立对照组、I/R组和HPC +I/R组，每组10只大鼠，检测各组肺组织湿重与干重比，肺组织丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)及髓过氧化物酶(MPO)活性。结果： I/R组大鼠肺组织湿重与干重比较对照组明显增加 (P<0.05) ，肺组织SOD活性显著降低(P<0.01), MDA含量和MPO活性明显增高 (P<0.05)；HPC+I/R组大鼠上述指标较I/R组均明显改善，差异有显著性。结论： 大鼠整体HPC可能通过减轻氧化应激反应，保护肺的缺血再灌注损伤。

【关键词】  缺血; 肺； 再灌注损伤; 低氧预处理; 大鼠，Sprague-Dawley

　　［Abstract］Objective: To investigate the protective effect of hypoxic preconditioning (HPC) on lung ischemia-reperfusion injury in rats. Methods: HPC model was established with 5 times of repetitive sublethal hypoxia. Thirty rats were randomly divided into the following three groups (n=10 in each): control group, ischemia-reperfusion injury group (group I/R), and group HPC+I/R. I/R injury model rats underwent 45 min of left hilar ligation followed by 120 min of reperfusion. The ratio of wet/dry weight of lung tissue was measured and calculated. The contents of malondialdehyde (MDA), and activities of superoxide dismutase (SOD) and myeloperoxidase (MPO) in lung tissue were determined with spectrophotometry. Results: In group I/R,the wet/dry weight ratio of lung was significantly higher than that of control group (P<0.05), and the MDA content and MPO activity in lung tissue were dramatically higher (P<0.05), SOD activity was significantly lower (P<0.01) than those of control group. In group HPC+I/R, that rats subjected to HPC, these oxidative stress indexes were significantly improved when rats exposed to ischemia-reperfusion.Conclusion: Whole-body hypoxic preconditioning in rats can protect lung from I/R injury by reducing oxidative stress.

　　［Key words］ ischemia; lungs; reperfusion injury; hypoxic preconditioning; rats，sprague-dawley

    缺血再灌注 (ischemia-reperfusion，I/R) 损伤现象被发现以来,已受到广泛关注。低氧或缺血预处理(hypoxic/ischemic preconditioning，HPC/IPC)是目前认为能有效地防治I/R损伤的手段之一。越来越多的研究表明，HPC/IPC产生的内源性保护现象不仅存在于多种动物的心脏，而且存在于脑、肝和肾等多种器官和组织细胞，但其作用机制至今尚未完全阐明。临床发现休克、心脑复苏、肺栓塞治疗后,肺都将经历I/R过程，且不可避免地受到不同程度的损伤。因此，肺I/R损伤及其所导致的肺功能障碍和防治也逐渐被人们重视。离体实验研究表明IPC对肺I/R损伤有保护作用[1,2]，但也有研究认为大鼠左肺门5 min的IPC并不能减轻肺I/R损伤[3]。本实验在整体动物水平上初步观察大鼠经HPC后对肺I/R损伤的保护作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料 

　　成年SD大鼠，体重180~210 g，雌雄不拘，由贵州省实验动物中心提供。超氧化物岐化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、髓过氧化物酶（MPO）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。主要仪器有：动物呼吸机（成都泰盟科技有限公司），低温高速离心机（德国, Eppendorf），核酸蛋白分析仪（美国, Bio-Tek），电热恒温鼓风干燥箱（上海路达实验仪器有限公司），754紫外可见分光光度计（上海第三分析仪器厂）。

　　1.2  方法

　　1.2.1  低氧预处理（HPC）动物模型 

　　吕国蔚等[4]的方法，稍作改进。将大鼠放入620 ml的广口瓶内，立即用橡皮塞密闭，当大鼠出现喘呼吸时, 将大鼠取出并立即移入另一个相同容积的广口瓶内、密闭，如此反复操作5次，建立低氧预处理模型。

　　1.2.2  肺I/R动物模型 

　　10％水合氯醛2 ml/kg腹腔麻醉, 气管插管, 接动物呼吸机。经左前胸第5肋间开胸,游离左侧肺门,用生理盐水稀释肝素50 U至500 μl经尾静脉注入，5 min后于肺充盈末用手术丝线通过肺门双活结套扎左侧肺门，45 min后松开，再灌注120 min。对照组左肺门穿线但不结扎。

　　1.2.3  实验分组
 
　　（1）对照组：开胸后游离左肺门，穿线不结扎，不予其他处理；（2）肺I/R组：用手术丝线双活结套扎左肺门，45 min后开放，再灌注120 min；（3）HPC+肺I/R组：经HPC后的大鼠进行肺I/R，方法同I/R组。

　　1.2.4  标本采集和处理 

　　实验结束后立即取出左肺，切取中下段肺组织约0.2 g，置于新鲜配制的10％中性福尔马林固定24 h，常规石蜡包埋切片，供HE染色；其余肺组织称重后-70 ℃冻存，以便分别进行各项生化指标检测及肺湿重与干重比。

　　1.2.5  肺组织湿重与干重比值 

　　取出已称重的冻存的肺组织，放置电热恒温鼓风干燥箱中，80 ℃连续烘烤24 h后取出，在天平上分别称取肺组织干重，最后按公式计算：肺湿重与干重比值=（湿重-干重）/干重。

　　1.2.6  肺组织MDA含量、SOD活性、MPO活性 

　　严格按试剂盒说明书制备样品，并用分光光度计测定吸光度值，再通过公式计算出组织匀浆液中的MDA含量、SOD活性和MPO活性。

　　1.3  统计学处理　　

　　所有数据用均数±标准差表示，用SPSS10.0统计软件作统计学分析，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有显著性。

　　2  结果

　　2.1  形态学观察    

　　光镜下，对照组肺泡腔内无水肿、出血及坏死，间隔无增宽，无炎细胞浸润，结构清晰可见。肺I/R组肺泡腔内明显出血、水肿，血管扩张，炎性细胞浸润明显，并有局灶性肺气肿，肺泡间隔增宽，偶见局灶性坏死，组织、细胞结构紊乱。HPC+I/R组可见少量的炎性细胞浸润，少量肺泡间隔出现断裂，无明显出血、水肿，组织、细胞结构仍清晰，损伤程度较肺I/R组明显减轻，见图1。

　　2.2  肺组织湿重与干重比值，见表1。结果表明HPC能减轻肺组织的I/R损伤，减轻肺水肿。表1  各组肺组织湿重与干重比值（略）注：与对照组比较，(1)P<0.05；  与I/R组比较，(2)P<0.05。

　　2.3  肺组织MDA含量及SOD、MPO活性见表2。结果提示HPC能有效地抑制肺I/R时的氧化应激反应及中性粒细胞介导的作用。表2  肺组织MDA含量及MPO、SOD活性的变化（略）注：与对照组比较，(1)P<0.05；(2)P<0.01； 与肺I/R组比较：(3)P<0.05，(4)P<0.01。

　　3  讨论　　

　　自1960年Jennings第一次提出I/R损伤的概念后，再灌注损伤日益受到重视。1986年，Murry等[5]首先发现了IPC现象，之后人们以鸡胚、鼠科动物、兔、狗，乃至人体为研究对象，进一步证明了IPC/HPC是机体抗缺氧或缺血的一种内源性保护现象，但确切机制尚不明确，其可能的机制包括谷氨酸和腺苷受体激活、ATP敏感性钾通道、一氧化氮、氧化应激等。　　

　　本实验在建立大鼠HPC模型的基础上，再复制大鼠单侧肺I/R损伤模型，观察HPC对肺I/R损伤的影响。肺I/R损伤后的基本病理改变是肺毛细血管通透性增高, 表现为血管内渗出物增多、肺湿重与干重比值增加、蛋白漏出、肺通透性指数增高等[6]。实验发现肺I/R后，肺组织湿重与干重比值较对照组明显增高，而经过HPC后再进行肺I/R，肺组织湿重与干重比值明显回降, 表明肺毛细血管损伤程度大大减轻。光镜下，肺I/R组肺泡腔内可见明显的出血、水肿、炎性细胞浸润，组织、细胞结构紊乱；HPC+肺I/R组虽有少量炎细胞浸润及局灶性改变，但比肺I/R组肺组织病理改变明显减轻，表明HPC减轻了I/R对肺组织的损伤作用。    

　　肺I/R时由于氧自由基过量产生和组织抗氧自由基能力失衡, 导致大量氧自由基产生, 从而引起组织损伤。肺I/R时肺组织可以通过黄嘌呤氧化酶系统，白细胞“呼吸爆发”等途径产生大量的氧自由基，同时内源性的抗氧化酶类，如SOD等被消耗，导致抗氧化能力下降，引发肺组织的脂质过氧化损伤。MDA是过氧化脂质降解产物, 其含量可反映机体脂质过氧化的程度。实验结果表明，肺I/R组肺组织的SOD活性明显降低，而MDA的含量明显增高；HPC+肺I/R组虽然与对照组比较SOD有所降低，MDA含量有所增高，但差异无显著性 (P>0.05)，但与I/R组比较差异有显著性。这些结果表明，HPC可以显著提高机体的抗氧化能力, 减轻肺I/R时氧自由基对肺组织的损伤，从而起到对肺的保护作用。MPO是中性粒细胞嗜天青颗粒所释放的过氧化物酶类，其含量与中性粒细胞数量有极显著的相关性, 检测组织中MPO含量往往可以反映中性粒细胞浸润的程度及活性[7]。肺I/R损伤过程中，中性粒细胞浸润、激活是引起肺I/R损伤的主要原因之一[8] 。实验显示，肺I/R组肺组织MPO活性比对照组有明显升高，而HPC+I/R组与 I/R组相比较明显降低，表明肺I/R后有大量的炎性细胞浸润、激活，引起肺组织损伤，而HPC后MPO活性明显降低，说明HPC能够抑制中性粒细胞浸润、激活，因而可起到减轻肺I/R损伤的作用。   

　　本研究显示，HPC能够减轻肺组织的I/R损伤，这与国外报道的结果一致[9]。实验结果还提示HPC的保护作用可能通过改善肺毛细血管的通透性、减轻肺的氧化应激反应、减少中性粒细胞的聚集等机制得以实现。

【文献】
  　　[1] Featherstone RL, Chambers DJ, Kelly FJ. Ischemic-preconditioning enhances recovery of isolated rat lungs after hypothermic preservation [J]. Ann Thorac Surg, 2000(1): 237.

　　[2]李建华, 司志萍，卢佳怡，等.缺血预处理对大鼠肺缺血/再灌注损伤的保护作用[J]. 应用生杂志，2003(2): 137-140.

　　[3]Pilla ES, Vendrame GS, Sánchez PG,et al.Ischemic preconditioning by selective occlusion of the pulmonary artery in rats [J]. J Bras Pneumol，2008(8):583-589.

　　[4]吕国蔚, 史美棠, 李凌, 等。急性重复缺氧对小鼠缺氧耐受性的影响及其机制的初步探讨[J].中国病理生理杂志,1992(4):425-429.

　　[5]Murry CE, Jennings RB, Reimer KA. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium [J]. Circulation, 1986(74):1124-1136.

　　[6]Friedrich I, Spillner J , Lu EX, et al. Ischemic pre-conditioning of 5 minutes but not of 10 minutes improves lung function after warm ischemia in a canine model [J]. J Heart Lung Transplant, 2001(9):985-995.

　　[7]Bradley PP, Priebat DA, Christensen RD, et al. Measurement of cutaneous inflammation: Estimation of neutrophil content with an enzyme maker [J]. J Invest Dermatol,1982(78)：206.

　　[8]Michael J Eppinger , Michael L Jones , Micheal Deeb , et al. Pattern of injury and the role of neutrophils in reperfusion injury of lung [J]. J Surg Res, 1995(58)：713-718.

　　[9]Zhang SX, Miller JJ, Gozal D, et al. Whole-body hypoxic preconditioning protects mice against acute hypoxia by improving lung function [J]. J Appl Physiol,2004(1): 392-397.