大鼠海洛因依赖期间睾丸CgA-IR细胞的免疫组织化学研究

【摘要】  　　目的： 探讨大鼠睾丸嗜铬颗粒素A (CgA)免疫反应细胞在海洛因依赖期间的作用。方法： 应用免疫组织化学SABC法及图像分析方法，研究大鼠海洛因依赖期间睾丸CgA免疫反应（IR）细胞形态学及功能的变化。结果： 在生精小管之间的睾丸间质内可见到CgA-IR细胞，阳性产物存在于细胞胞质中；与正常组及对照组比较，海洛因依赖组大鼠睾丸CgA-IR细胞免疫染色强度明显减弱，阳性细胞数量明显减少（P<0.05）；图像分析结果表明，CgA-IR细胞的平均灰度值在海洛因依赖期间呈增高趋势（P<0.05），尤以17 d时最高。结论： 在海洛因依赖期间，大鼠睾丸CgA-IR细胞数量减少、分泌功能减弱，与机体的调节过程有关。

【关键词】  嗜铬颗粒； 睾丸； 海洛因依赖； 免疫组织化学； 大鼠，Sprague-Dawley

　　［Abstract］Objective: To explore the possible function of Chromogranin A immunoreactive (CgA-IR) cells in rat testis during heroin dependence.Methods: Immunohistochemical SABC method and imagine analysis were used to study the morphological and functional changes of CgA-IR cells in rat testis during heroin dependence. Results: The CgA-IR cells were located in the interstitial tissue between the seminiferous tubules, and the positive substances were in the cytoplasm. As compared with normal control group and saline control group, in heroin dependent group the number of CgA-IR cells(P<0.05), and the immunohistochemical staining intensity decreased evidently. The result of image analysis showed that the average gray degree of the CgA -IR cells increased during  heroin dependence (P<0.05)，especially on the 17th day. Conclusions: The number and the secretion function of testis CgA-IR cells decrease during heroin dependence which might be involved in the physiological regulation of heroin dependence.

　　［Key words］ chromaffin granules; testis; heroin dependence; immunohistochemistry; rats, sprague-dawley
   
　　嗜铬颗粒素A (CgA)是广泛分布于神经内分泌细胞分泌颗粒内的一类蛋白质，具有调节机体神经-内分泌-免疫的功能。同时，CgA可作为一种肿瘤标志物，监测肿瘤的及转移。海洛因对机体的损害广泛而严重，特别是神经系统和下丘脑及垂体损伤后的效应损伤造成机体内神经递质、神经调质及内分泌免疫功能的失调[1]，目前尚未见对海洛因依赖期间大鼠睾丸内分泌细胞形态学变化或CgA表达改变的有关报道。2006年4月-2007年10月，应用免疫组织化学、图像分析对大鼠海洛因依赖期间睾丸CgA免疫反应细胞的分布、形态及数量的改变进行研究，以探讨睾丸CgA免疫反应细胞在海洛因依赖期间的作用。

　　1  材料与方法

　　1．1  海洛因依赖动物模型　　

　　成年雄性SD大鼠55只，体重180~220 g（贵阳医学院实验动物中心提供），按配对原则随机分为正常对照组（NCG）5只，生理盐水对照组（SCG）25只，海洛因依赖组（HDG）25只。参照[2]制作动物模型，HDG大鼠腹部皮下注射海洛因药液(纯度为61.48 %，由贵州省公安厅提供)，首日剂量为3 mg/ kg，2次/d (上午8时，下午3时)，连续9 d至成瘾，第9天剂量为27 mg/kg。此后成瘾大鼠每日上午8时注射1次，维持剂量为27 mg/kg，直至取材。SCG大鼠按体重每日注射与HDG相当剂量的生理盐水，并与HDG大鼠同时处死。NCG不予任何处理，常规喂养。

　　1．2  取材及标本处理　　

　　HDG及SCG大鼠分别于模型建立的第10、17、24、31、38天取材，每次每组处死5只，NCG同期取1只处死。取睾丸标本，多聚甲醛液固定，常规石蜡包埋，制成4 μm厚的连续切片，切片间隔56 μm。

　　1．3  免疫组织化学SABC法   

　　按照免疫组织化学SABC法进行染色。主要步骤：切片常规脱蜡入水，10%甲醇-H2O2室温下10 min，正常山羊血清（1:50）封闭室温下20 min，依次滴加一抗（兔抗CgA血清，工作浓度1∶100，武汉博士德生物工程公司提供）4 ℃孵育过夜，羊抗兔IgG（1∶100）37 ℃孵育20 min，SABC复合物（1∶100）37 ℃孵育20 min，DAB-H2O2室温下显色，水洗，苏木精复染细胞核，中性树胶封片。方法对照采用PBS缓冲液代替CgA抗血清。

　　1．4  图像分析　　

　　随机选取HDG组与SCG组第10、17、24、31、38天切片，每组每个时间点3例，NCG组3例，应用BioMias图像分析系统进行检测。在40倍物镜下，每例随机选取5个视野，测CgA-IR细胞的平均灰度值，并计数每个视野的有核阳性CgA-IR细胞数。应用SPSS11.5软件包对所得数据进行统计分析，P<0.05差异具有显著性。

　　2  结果

　　2．1  CgA-IR细胞免疫组织化学观察　　

　　光镜下，在生精小管之间的睾丸间质内可见到CgA-IR细胞，阳性细胞定位同睾丸间质细胞。经DAB-H2O2液显色后，免疫阳性产物呈棕黄色细颗粒存在于胞质内，方法对照切片未见阳性细胞。贵阳医学院学报  33卷    6期郭  斌等  大鼠海洛因依赖期间睾丸CgA-IR细胞的免疫组织化学研究SCG各组时间点与NCG组睾丸CgA-IR细胞的分布、形态和免疫染色强度未见明显差别，SCG组各时间点之间也无明显差别。与NCG和SCG比较，HDG各时间点睾丸CgA-IR细胞分布未见明显变化，但CgA-IR细胞的免疫染色强度明显减弱（图1）。

　　2．2  CgA-IR细胞的图像分析结果

　　2．2．1  CgA-IR细胞的平均灰度值 

　　如表1所示，SCG组与NCG组CgA -IR细胞平均灰度值差异无显著性（P﹥0.05）；SCG组各时间点之间CgA -IR细胞平均灰度值的差异也无统计学意义（P﹥0.05）。HDG组与NCG、SCG组比较，CgA -IR细胞的平均灰度值显著增高（P﹤0.05）。

　　2．2．2  有核CgA-IR细胞数 

　　从表2可见，SCG组与NCG组CgA -IR细胞计数差异无统计学意义（P﹥0.05），SCG组各时间点之间CgA -IR细胞计数的差异也无显著性（P﹥0.05），HDG组CgA -IR细胞的细胞计数与NCG、SCG组比较明显减少（P﹤0.05）。表1  各组大鼠睾丸CgA-IR细胞的平均灰度值（略）注：(1)与NCG组比较P﹥0.05，(2)SCG组内比较P﹥0.05，(3)与NCG和SCG比较P﹤0.05。表2  各组大鼠睾丸有核CgA-IR细胞数／视野的比较（略）注：(1)与NCG组比较P﹥0.05，(2)SCG组内比较P﹥0.05，(3)与NCG和SCG组比较P﹤0.05。

　　3  讨论　　

　　近年来的研究认为，CgA是存在于神经内分泌细胞和肿瘤细胞中的最为特异、敏感和可靠的标记物。用免疫组织化学和免疫测定法，CgA可鉴定神经内分泌肿瘤，包括嗜铬细胞瘤、甲状旁腺瘤、肺小细胞癌等[3，4]，并有助于肿瘤的分型及预后的判断[5]。CgA是一种水溶性酸性糖蛋白，还存在于多种动物的神经元和一些内分泌细胞中[6]。有报道认为，大鼠胰岛内有CgA的免疫阳性物质，与胰高血糖素共存于胰岛的A细胞中[7]。CgA也分布于人与大鼠胃窦部G细胞、D细胞和EC细胞[8]。CgA作为分泌颗粒中的可溶性蛋白，可通过与ATP相互作用，使颗粒中的其它可溶性蛋白质保持稳定，参与共存激素的浓缩、包装过程；它还可能是一些生物活性肽的前体[9]，调节激素加工相关酶活性及共存激素的分泌[10,11]。本课题组已对CgA与β-EP在大鼠睾丸的表达和定位进行研究，发现CgA与β-EP在细胞中有共存（另文发表）。　　

　　本实验观察到海洛因依赖大鼠睾丸CgA-IR细胞的数量减少，免疫染色强度减弱，平均灰度值增高，提示海洛因依赖期间CgA表达减少。推测与海洛因依赖期间睾丸间质细胞内β-EP的分泌减少有关（另文发表），并与下丘脑-垂体-性腺轴功能紊乱有关。

【】
  　　[1]苏木金, 戴廷恩, 张豫,等. 海洛因成瘾对下丘脑神经内分泌激素系统的影响[J]. 中华核医学杂志, 1999(2): 111-112.

　　[2]潘贵书, 徐国强, 李淑芳. 海洛因成瘾大鼠模型的建立[J]. 贵阳医学院报，1997(增)：46-46.

　　[3]Abbona G, Papotti M, Viberti L, et al. Chromogranin A gene expression in non-small cell lung carcinomas[J]. J Pathol,1998（2）：151-156.

　　[4]Baudin E, Gigliotti A, Ducreux M,et al. Neuron-specific enolase and chromogranin A as markers of neuroendocrine tumours[J]. Br J Cancer,1998（8）：1102-1107.

　　[5]Schafer MK,Nohr D,Romeo H，et al.Pan-neuronal expression of chromogranin A in rat nervous system[J].Peptides,1994(2):263-279.

　　[6]冯超，李汉忠.嗜铬素A和突触素在肾上腺肿瘤中的表达及其临床意义. 中华肿瘤杂志，2005（8）：486-488.

　　[7]陈丽华，张远强. 大鼠胰腺嗜铬颗粒素A分布的免疫组织化学研究[J].组织化学与细胞化学杂志，1996(4):411-414.

　　[8]Portela Gomes GM , Stidsberg M. Chromogranin A in the human gastrointestinal tract : an immunocytochemical study with region-specific antibodies[J].J Histochem Cytochem, 2002(11):1487-1492.

　　[9]Tatemoto K, Efendic S, Mutt V, et al. Pancreastatin, a novel pancreastic pPep tide that Inhibits insulin secretion [J]. Nature, 1986(324):476-478.

　　[10]Winkler H, Fisher-Colbrie R. The chromogranin A and B:the first 25 years and future perspectives[J].Neuroscience,1992(3):497-528.

　　[11]Simon JP, Baber MF, Aunis D. Proteolytic processing of chromogranin A in cultured chromaffin cells[J].Biochimica Biophysica Acta.1990(2):23-130.