登革2型病毒NGC株E基因部分序列原核蛋白表达
【摘要】 目的： 构建登革2型病毒NGC株E基因区1~476 bp的原核表达载体并进行原核表达。方法： 将登革2型病毒NGC株E基因区部分序列克隆入原核表达载体pET28a(+)，命名为pET28a(+)-En；经酶切、PCR及测序鉴定后转化BL21（DE3）菌株，用IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE、Western印迹鉴定表达蛋白；对表达蛋白进行纯化，并滴定对C6/36细胞的TCID50。结果： （1）成功构建了pET28a(+)-En原核表达重组质粒,SDS-PAGE分析表明，E基因区部分序列获得高效表达，相对分子量约为23 kD,表达量约占菌体总蛋白的29%；Western印迹表明该目的蛋白可与登革2型病毒鼠单克隆抗体结合；（2）用Ni柱亲和层析法纯化原核表达蛋白，纯度达90%；（3）DEN-2 NGC株E基因部分序列原核表达蛋白对C6/36细胞的TCID50为10-4.88/0.1 ml。结论： pET28a(+)-En可在BL21（DE3）菌株中高效表达，DEN-2 NGC株E基因部分序列原核表达蛋白对C6/36细胞有一定的细胞毒作用。
【关键词】 登革热病毒； 基因，E； 基因顺序； 基因表达
［Abstract］ Objective: To construct expression vector of gene E partial sequence of dengue virus type 2 strain NGC for prokaryotic expression. Methods： Gene E partial sequence of dengue virus type 2 strain NGC was amplified by RT-PCR, inserted into prokaryotic vector pET28a(+), and transformed E. coli BL21 cells. The gene partial sequence was expressed under the induction of IPTG. The expressed products was identified by SDS-PAGE and Western-Blot and purified. The cytotoxicity (indicated as TCID50) of the purified protein on C6/36 was detected. Results： Prokaryotic expression recombinant vector, pET28a(+)-Eb, was successfully constructed. SDS-PAGE assay showed that the gene E partial sequence could be highly expressed in BL21,and the yields were 29% of total bacterial proteins. The expressed protein had a relative molecular weight of 23KDa, and Western-Blot indicated that the expression products could specifically react with monoantibody against dengue virus type 2. Cytotoxic experiments in vitro suggested that the protein had relatively cytotoxicity to C6/36, and the TCID50 was 10~4.88/0.1ml. Conclusion： pET28a(+)-Eb containing gene E partial sequence can be highly expressed in BL21. The antigenicity of the produced proteins provide a potential source of reagent for dengue virus diagnosis；The expressed proteins have some cytotoxicity to C6/36.
［Key words］ dengue virus; genes, E; gene order; gene expression
登革病毒（Dengue Virus,DEN）是经埃及伊蚊和白纹伊蚊传播的黄病毒科黄病毒属病毒家族成员，有4种典型的血清型。DEN感染人类不仅可引起登革热（Dengue Fever，DF），还可引起登革出血热（Dengue hemorrhagic Fever，DHF）和登革休克综合症（Dengue Shock Syndrome，DSS）。E蛋白是DEN的包膜蛋白,存在抗体依赖的增强感染作用表位和免疫保护表位。E蛋白全长约500个氨基酸,N端80%的氨基酸组成膜外区,C端20%的氨基酸构成跨膜疏水区[1]。E蛋白可分为3个结构区(DⅠ、DⅡ、DⅢ),类似于以前定义的抗原区(C、A和B)[2]。近年来，有学者曾用多种表达系统来表达E蛋白,用于E蛋白结构与功能的研究及基因工程疫苗的研制[3]，但未曾有学者对A区进行表达。本课题将DEN NGC株E基因A区部分序列分别克隆入原核表达载体，经酶切、PCR及测序鉴定后转化BL21（DE3）菌株，用IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE、Western印迹鉴定表达蛋白，并对表达蛋白进行纯化，滴定对C6/36细胞的TCID50。
1 材料和方法
1.1 材料
白蚊伊蚊传代细胞（C6/36细胞），由广州中山大学医学院微生物学教研室江丽芳、郭辉玉教授馈赠。JM109、BL21(DE3)购自北京天为时代科技有限公司。pET28a(+)购自上海捷瑞生物工程有限公司。IPTG、EcoRⅠ、XhoⅠ、Amp、Kan、T4DNA连接酶，购自大连宝生物工程有限公司。HIS-Bind Purification Kit、BugBusterTM蛋白抽提试剂购自Novagen公司。鼠抗登革病毒2型单克隆抗体（McAb），由中山大学医学院微生物学教研室郭辉玉、江丽芳教授惠赠。羊抗鼠IgG抗体-HRP购于深圳晶美生物制品有限公司，NC膜,购自华美生物工程公司。
1.2 方法
1.2.1 目的基因的合成
根据Genbank对DEN-2 NGC株E基因区部分序列，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成NGC株E基因区部分序列的长度为492 bp的基因片段（加两端的酶切位点），两端含有EcoR1和Xho1酶切位点。
1.2.2 原核表达载体pET28a(+)构建及鉴定
用内切酶EcoR1和Xho1分别双酶切目的基因和质粒pET28a(+)，PCR纯化试剂盒回收目的基因片段和载体片段，T4DNA连接酶进行连接，连接产物转化E.coli BL21感受态细胞后,涂布于含Kana(浓度100 mg/L)的LB固体培养基上,随机挑取单克隆接种于相应的液体培养基中,提取质粒,进行双酶切及PCR鉴定,并送上海捷瑞生物工程有限公司测序。
1.2.3 重组克隆的诱导表达及表达蛋白检测
用LB培养基培养已鉴定的重组菌，180~200 r/min,37 ℃培养至A600约为0.5时，加IPTG(终浓度为1 mmol/L)37 ℃继续诱导。分别于1、3、6、9 h各收集1 ml菌液，离心回收沉淀加50 μl1×SDS-PAGE上样缓冲液重悬，100 ℃煮沸5 min,12 000 r/min离心1 min,取上清液进行12%的SDS-PAGE，考马斯亮蓝R-250染色，检测重组蛋白的表达。
1.2.4 重组蛋白的纯化
应用镍-螯合物琼脂糖树脂柱纯化诱导的重组蛋白，按试剂盒说明书操作。
1.2.5 表达产物与登革病毒多克隆抗体的免疫印迹反应
将表达的重组蛋白行SDS-PAGE后，转移到NC膜，分别与第一抗体（DEN1-4鼠特异单抗）和第二抗体（羊抗鼠HRP-IgG）反应，并用DAB显色液显色。
1.2.6 原核表达蛋白TCID50的滴定
用D-MEM维持液将表达蛋白作10-1到10-8的10倍稀释，分别加入96孔细胞培养板的1日龄C6/36单层细胞，100 μl /孔，每个稀释度3个复孔，设细胞和病毒对照，于37 ℃吸附2 h，弃液，加维持液，5% CO2 28 ℃培养，每日观察细胞病变（CPE），观察5 d，与正常细胞对照无明显退变，病毒对照孔出现明显CPE为判断终点，TCID50。
2 结果
2.1 原核表达重组质粒的酶切鉴定提取重组质粒DNA进行EcoR1和Xho1双酶切分析，琼脂糖电泳可观察到476 bp和5.3 kb的条带（图1），与理论的质粒和目的基因分子量大小一致，说明克隆成功。
2.2 测序鉴定委托上海捷瑞公司对经酶切鉴定后将重组体pET28a(+)-En进行序列测定,NGC株E基因区部分序列的长度为492 bp的基因片段插入载体后阅读框架正确。测序结果见图2。
2.3 表达蛋白的检测经SDS-PAGE、考马斯亮蓝R-250染色观察，含重组质粒的诱导菌在分子量约为23 kD处出现1条蛋白条带，经纯化在相应位置也出现条带，重组蛋白的大小与理论预测值一致。从蛋白带型来看，诱导3 h的重组蛋白表达量最高（图3），而未诱导的重组质粒转化菌在相应位置的条带较弱。
2.4 表达产物的抗原性分析Western-blot 结果显示，含重组质粒的细菌在诱导后全菌的裂解液与登革2型病毒小鼠多克隆抗体有特异的印迹反应，表明目的蛋白有抗原活性（图4），而诱导前菌体蛋白无显色带。
2.5 NGC株E基因区部分序列原核表达蛋白对C6/36的细胞毒作用用不同稀释度DEN-NGC株E基因区部分序列原核表达蛋白接种C6/36细胞，第3天观察到从10-1~10-6稀释度的细胞出现不同程度的细胞病变,而10-7~10-8稀释度组和细胞对照孔未出现病变。经计算该蛋白对C6/36细胞的TCID50为10-5.31，细胞病变见图5。
3 讨论
DEN有4种血清型(DEN124) ,其基因组为单股正链RNA ,长约11 kb ,E 蛋白全长约500个氨基酸,N 端80%的氨基酸组成膜外区,C端20%的氨基酸构成跨膜疏水区[4]；E蛋白分为3个结构区(D Ⅰ、D Ⅱ、D Ⅲ) ,类似于以前定义的抗原区(C、A 和B)[5]。A区(残基50～130)是线性区域,可刺激病毒中和抗体的产生;B 区(残基300～400) 诱导病毒中和抗体和血凝抑制抗体的产生;C 区(残基130～185) 是隔断A 区的区域,可被蛋白水解酶降解,部分表位也可刺激中和抗体的产生[6，7]。对于DEN2 型而言, ss1(cys32 cys30 形成二硫键) 稳定氨基端的环, ss2 ( cys602-cys121)、ss3 (cys742cys105) 和ss4 (cys922cys116) 稳定DⅡ的氨基端部分,包含氨基酸98~110之间的病毒膜融合序列,ss5 (cys1852cys285) 稳定D Ⅱ区羧基端的环，ss6 (cys3022cys333) 是D Ⅲ区唯一的二硫键[8]。E 蛋白能和宿主表面受体相互作用从而在病毒入侵过程中起至关重要的作用，E 蛋白还能诱导宿主产生保护性的中和抗体[9]。因此认为E蛋白可作为亚单位候选疫苗的良好抗原。国内外学者分别运用不同的载体、不同的表达系统对DEN外膜基因的全长进行了表达,主要的表达系统包括大肠杆菌、毕赤酵母、昆虫细胞Sf9[10],但表达产量均较低,不利于重组蛋白的纯化及研究应用。因此,亦有采用截短的E 基因片段进行表达，国内外有学者表达了B区和C区蛋白，但未曾有学者对A区进行表达。 本课题通过RT-PCR扩增DEN NGC株E蛋白1~159aa区段的基因片段，该区段包含E蛋白抗原区的A区。同时将该基因克隆入原核表达载体pET28a(+)，将重组体转化BL21（DE3）菌株，用IPTG分别于3、6、9、12 h诱导蛋白表达，发现经过3 h诱导后蛋白含量相对较高，于20 ℃诱导表达的蛋白以可溶形式存在。通过SDS-PAGE、Western印迹鉴定表达蛋白,E基因区蛋白获得高效表达，其相对分子量为23 kD,表达量约占菌体总蛋白的29%，Western印迹表明该目标蛋白具有与鼠抗登革2型病毒单克隆抗体结合的抗原活性。
【】
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