FAK和MMP?9 蛋白在结直肠癌组织中的表达及相关性研究

                     作者：梁水权 吕益中 王羲中 王育烽

【摘要】  目的 探讨斑激酶(focal adhesion kinase , FAK)和基质金属蛋白酶?9（matrix metalloproteinase，MMP?9）在结直肠癌中的表达。方法 采用免疫组化法检测了67例结直肠癌和癌旁组织以及51例正常结直肠黏膜组织中FAK和MMP?9的表达，并比较了不同临床病理参数下FAK和MMP?9的表达情况。结果 结直肠癌组织FAK阳性表达（77.6%，52/67）高于癌旁组织（50.8%，34/67）和正常结直肠黏膜组织（37.3%，19/51），结直肠癌组织中MMP?9染色阳性率（73.1%，49/67）高于癌旁组织（49.3%，33/67）和正常结直肠黏膜组织（31.4%，16/51)，不同肿瘤分化、局部分期以及有无淋巴结转移者FAK和MMP?9表达水平存在差异(P<0. 05)。结论 FAK和MMP?9在结直肠癌组织高表达，且FAK和MMP?9表达呈正相关，可能成为判断结直肠癌预后的指标之一。

【关键词】  结直肠肿瘤;FAK;MMP?9;免疫组织化学

    [Abstract]  Objective  To investigate the correlation and expression of focal adhesion kinase (FAK) and matrix metalloproteinase?9(MMP?9) in colorectal carcinoma. Methods  Expression of FAK and MMP?9 were detected immunohistochemically in 67 cases of colorectal carcinoma and 51 cases of normal colorectal mucosa. Results  The expression of FAK was higher in colorectal carcinoma tissue (77.6%, 52/67) than that in peri?neoplasm tissue (50.8%, 34/67) and normal colorectal mucosa tissue (37.3%, 19/51). The expression of MMP?9 was higher in colorectal carcinoma tissue (73.1%, 49/67) than that in peri?neoplasm tissue (49.3%, 33/67) and normal colorectal mucosa tissue (31.4%, 16/51). The expressions of FAK and MMP?9 had significant differences in colorectal tissue with different differentiation, local stage and lymph node metastasis status (P≤0. 05). Conclusion  FAK and MMP?9 are highly expressed in colorectal carcinoma tissue. They are positively correlative, and may become prognostic factors of colorectal carcinoma.

    [Key words]   Colorectal carcinoma; Focal adhesion kinase (FAK); Matrix Metalloproteinase?9 (MMP?9); Immunohistochemistry

    结直肠癌目前已成为消化外科最常见的恶性肿瘤。其癌细胞可穿透肠壁形成局部播散，亦可穿破肿瘤滋养血管或淋巴系统导致全身转移［1］。腹腔播散和远处转移依赖于肿瘤细胞具有增殖、粘附和穿破基底组织的能力，癌细胞间的粘附性能调节机制目前被认为是肿瘤演进和转移的关键因素［2, 3］。近年来研究发现，整合素介导的信号传导通路在恶性肿瘤细胞远处播散转移中具有主要作用，粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK) 是整合素介导的信号转导通路的中心分子，被活化后可显著增强c?fos 和c?jun 等原癌基因的表达，进而促进肿瘤细胞演进、增殖、促进新生血管形成和介导肿瘤细胞与胞外基质(extracellular matrix,ECM)的粘附［4～6］。基质金属蛋白酶?9（matrix metalloproteinase，MMP?9）可降解ECM中的Ⅳ型胶原、Ⅴ型胶原以及弹力蛋白，促使肿瘤细胞穿过基底膜屏障［7, 8］。目前尚未见关于FAK 和MMP?9与结直肠癌生物学行为的关系以及FAK 和MMP?9之间相关性的报道。本文采用免疫组织化学方法，检测了67例结直肠癌组织中FAK和MMP?9 的表达情况，分析在结直肠癌中FAK与MMP?9的相关性。

    1  材料与方法

    1.1  一般资料  本组结直肠癌手术标本67例，男41例，女26例。年龄32～84 岁,平均（53.5±8.4）岁，中位年龄51岁。右半结肠癌21例,横结肠癌12例，左半结肠癌11 例，直肠癌23例。3例为两个癌肿同时发现。黑便53例次，大便变细25例次，大便习惯改变28例次，合并肠梗阻13例次，表现为恶液质6例次，43例出现两种以上的症状。所有患者术前均行结肠镜检查，术前病理明确诊断。另有51例体检行结肠镜检查的健康人群，随机取活检组织51份。

    1.2  手术方式  所有患者均按日本结直肠癌临床病理规约[9]行D3式廓清术，术后由高年资主治医师解剖肿瘤标本，挤压触诊法寻找淋巴结并完整游离,根据解剖部位对各组淋巴结进行分类标识分组，在病理检查单详细记录后送病理检查。肿瘤大小、部位、病理类型及浸润深度等病理参数通过病理检测获得。癌肿直径≤4 cm 42例，>4 cm 25例。按照WHO结直肠癌分级标准，高分化( Ⅰ级) 19 例，中分化( Ⅱ级) 23 例，低分化或未分化( Ⅲ级) 25例。浸润深度根据国际结直肠癌新TNM分期标准[10]：T1期肿瘤累及黏膜或黏膜下层，T2期肿瘤穿透肌层，T3期肿瘤浸透浆膜，T4期肿瘤直接累及临近器官。67例患者中，T1～T2期24例，T3～T4期43例；淋巴结转移45例，无淋巴结转移22例。

    1.3  主要试剂  FAK兔抗人多克隆抗体为武汉博士德生物工程公司产品，MMP?9鼠抗人单克隆抗体，羊抗鼠和羊抗兔二抗试剂盒、防脱载玻片以及DAB显色剂购自福州迈新生物技术有限公司。

    1.4  标本制备及免疫组化染色  所有标本均为10%甲醛固定24 h后，常规石蜡包埋，常温保存，连续切片层厚5 μm，每例均行连续切片的HE染色和免疫组化染色。免疫组化操作步骤严格按试剂盒说明书进行，FAK和MMP?9的一抗浓度为1∶50，二抗为即用型试剂，标本满12例进行免疫组化染色和HE染色，每批实验均以试剂公司提供的阳性对照片作阳性对照，以中性磷酸盐缓冲液代替—抗作阴性对照[2, 3]。

    1.5  结果判定及标准  以在细胞膜或细胞浆内出现散在棕黄色颗粒为阳性染色。每例切片随机选取5个高倍视野进行观察，按染色强度及阳性细胞数所占百分比综合计分［11］。染色强度：不着色计为0分，淡黄色计为1分，棕黄色计为2分，棕褐色为3分；阳性细胞数：小于总数的5%时计为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，大于50%为3分。染色强度得分与阳性细胞数得分相乘，0分计为阴性（-），1～3分计为弱阳性（+），4～5分计为中度阳性（++），大于或等于6分计为强阳性（+++）[5,7]。

    1.6  统计学处理  采用秩和检验来分析FAK和MMP?9的免疫组化阳性表达情况，采用单因素方差分析和χ2检验来比较不同病理特点之间FAK和MMP?9表达的阳性率，计数资料采用采用精确Bayes检验法进行统计学比较，FAK及MMP?9染色之间的关系采用Spearman等级相关分析，α设定为0.05，所有数据采用SPSS 13.0统计软件进行处理。

    2  结  果

    2.1  FAK在结直肠癌及其癌旁组织的表达  本组67例，FAK阳性表达52例，占77.6%；癌旁组织阳性表达34例，占50.8%；正常结直肠黏膜组织阳性表达19例，占37.3%，经单因素方差分析，癌组织、癌旁组织以及正常结肠上皮的FAK表达存在差异（t=2.18，P≤0. 05)；较强阳性和强阳性(++～+++) 表达率为55.2%（37/67），正常结直肠黏膜组织为21.7%（11/51），经χ2检验，两者间比较差异有显著意义(t=2.35，P≤0.05)。

    2.2  FAK表达与结直肠癌临床病理特征的关系  见表1。本组病例FAK表达水平与性别、年龄、肿瘤大小无关(P> 0.05)。高分化、中分化、低分化或未分化FAK阳性表达率分别为57.9%(11/19)、73.9%(17/23)、96.0%(24/25)；T1～T2期、T3～T4期FAK阳性表达率分别为54.2%(13/24)、90.7%(39/43)；有、无淋巴结转移者FAK阳表达率分别为91.1%(41/45)、50.0%(11/22)。

    2.3  MMP?9在结直肠癌及其癌旁组织的表达情况  本组67例结直肠癌组织中MMP?9染色阳性49例，阳性率为73.1%，癌旁组织阳性表达33例，占49.3%，正常结直肠黏膜组织阳性表达16例，占31.4%(16/51)。经单因素方差分析，癌组织、癌旁组织以及正常结肠上皮的MMP?9表达存在差异（t=2.15，P≤0. 05)。

    2.4  MMP?9表达与结直肠癌临床病理特征的关系  见表2。MMP?9表达与结直肠癌的局部分期、分化程度和淋巴结转移密切相关(P<0.05)。高分化、中分化、低分化或未分化结直肠癌FAK阳性表达率分别为42.1%(8/19)、73.9%(17/23)、96.0%(24/25) ；T1～T2期、T3～T4期FAK阳性表达率分别为45.8%(11/24)、88.4%(38/43)；有、无淋巴结转移者FAK阳表达率分别为86.7%(39/45)、45.5%(10/22)；经单因素方差分析和χ2检验，不同肿瘤分化、局部分期以及有无淋巴结转移者FAK表达水平存在差异(P<0. 05)，具体数据见表2。

    2.5  结直肠癌中MMP?9与FAK表达之间的关系  采用Spearman等级相关分析，FAK和MMP?9在结直肠癌中的表达存在正相关关系（r=0.765，P＜0.05）；而FAK和MMP?9在正常结直肠黏膜组织中的表达，无明显相关关系（r=0.225，P>0.50）。 表1  结直肠癌中FAK表达与各临床病理参数的关系 注：*经比较，不同肿瘤分化、局部分期以及有无淋巴结转移者FAK表达水平存在差异，P<0.05 表2  结直肠癌中MMP?9表达与各临床病理参数的关系注：*经比较，不同肿瘤分化、局部分期以及有无淋巴结转移者FAK表达水平存在差异，P<0.05

    3  讨  论

    FAK是Schaller等于1992年发现的一种非受体类蛋白，是整合素介导的信号传导途径中的一个重要信号分子，亦是细胞内多条信号传导通路的交汇点，磷酸化FAK表达的上调被认为在细胞基因点突变中起着重要作用，能够上调细胞增殖、扰乱细胞?细胞接触抑制、抗凋亡、促进细胞的侵袭以及血管生成等[2,5,6]。

    国内外学者报道了FAK在不同来源的肿瘤中存在表达上调现象，并与肿瘤的浸润转移相关。有研究发现在胃的癌前病变向胃癌的转化过程中，FAK的表达逐渐升高[4]。Cance等[2]发现正常胃和结肠黏膜组织FAK表达很弱，主要表达于基底层，而胃癌或结肠癌细胞的FAK表达明显升高且不局限于基底层。本文通过免疫组化比较结直肠癌组织和相对应癌旁组织的FAK表达，提示FAK在结直肠癌的癌旁组织的表达以弱阳性为主，而在癌组织表达为较强阳性和强阳性。我们的结果说明FAK在正常结直肠黏膜组织和癌旁组织中均表达，但只是表达强度较弱。本文结果还显示,FAK表达与结直肠癌组织的分化程度、局部浸润深度及淋巴结转移有明显相关性，分化程度愈低，临床分期愈晚，FAK阳性表达水平愈高，提示随着肿瘤的演进，FAK表达上调；而FAK基因过度表达预示预后不良。

    MMP?9是MMP家族的主要成员，其作用底物为明胶蛋白、Ⅳ和Ⅴ型胶原、蛋白聚糖、弹性蛋白以及纤粘连蛋白等构成ECM三维网状结构的重要成分[7]。肿瘤侵袭和转移的基本过程是瘤细胞穿过ECM屏障、血管壁的基底膜，以及穿出血管壁进入宿主周围和（或）远处组织微环境的过程。MMP?9可以有效地降解、破坏靠近肿瘤表面的基质和基膜，使瘤细胞可沿着缺失的基膜向周围组织侵袭，促进肿瘤侵袭和转移[3,8]。因此，MMP?9被认为与肿瘤的侵袭和转移有关。本实验通过结直肠癌组织与正常结直肠组织中MMP?9的表达对比，证实MMP?9在结直肠癌组织中高表达。我们的实验结果表明，MMP?9的表达随着淋巴转移的产生、远隔转移的发生、临床分期的提高而明显增高，说明了MMP?9作为蛋白水解酶在结直肠癌的侵袭和转移过程中起着重要的促进作用。

    体外研究证实，ECM中的纤粘连蛋白具有激活FAK分子的功能，FAK进而通过磷酸化方式激活胞浆功能蛋白，如细胞骨架蛋白和MMP等，从而实现癌细胞侵袭行为中的粘附和迁移[3,4,11]。作为FAK信号的下游分子，MMP?9几乎能降解细胞外基质的所有成分[11]。本文从组织学角度进一步探讨结直肠癌细胞侵袭性行为的有关分子机制，发现FAK与MMP?9表达具有明显的相关性，提示MMP?9可能作为FAK的效应分子促进了肿瘤的演进。

    本研究显示，联合检测FAK和MMP?9的表达可作为判断结直肠癌生物学行为的指标，对临床具有一定的指导意义。同时FAK是一个有潜在价值的结直肠癌标志物，可用于诊断和评估预后，也可能成为基因治疗结直肠癌的新靶点。

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