ER、PR和p53基因检测及DNA倍体分析对结直肠癌预后判断的意义

【摘要】  目的 探讨ER、PR表达和p53基因检测及DNA倍体对结直肠癌预后判断的意义。方法 采用RBA 法、免疫组织化学方法和流式细胞术对286例结直肠癌标本分别进行ER、PR表达和p53基因检测及DNA倍体分析并结合患者的临床资料进行分析。结果 ER、PR表达和p53基因检测及DNA倍体分析与结直肠癌患者预后均有明显相关，差异有极显著性意义（P<0.01）。DNA二倍体、p53基因检测和ER、PR的表达水平越强其患者预后越好。结论 结直肠癌ER、PR表达和p53基因检测及DNA倍体分析有助于结直肠癌患者的临床诊断及预后评估。

【关键词】  结直肠癌;ER;PR;p53;DNA倍体;预后

    [Abstract]  Objective  To investigate the significance of detection of estrogen receptor(ER), progesterone receptor (PR), p53 gene and DNA ploidy analysis to prognostic judgment of colorectal cancer. Methods ER, PR, P53 gene and DNA ploidy were examined by radiobioassay (RBA), immunohistochemistry, flow cytometry in 286 specimens of colorectal cancer. Results  The expressions of ER, PR, P53 gene and DNA ploidy correlated with prognosis of colorectal cancer patient(P<0.01). The higher the expressions of ER, PR, P53 gene and DNA ploidy，the better the prognosis. Conclusion  The detection of ER, PR, P53 gene and DNA ploidy analysis is useful to clinical diagnosis and prognostis judgment of colorectal cancer.

    [Key words]  Colorectal cancer; ER; PR; P53; DNA ploidy; Prognosis

    结直肠癌由于其临床及病理特征的不同，措施及预后也明显不同。近年来，雌激素受体（estrooen eceptor,ER）和孕激素受体（prooesterone eceptor,PR)的研究在非激素依赖性器官肿瘤已得到拓展。多数学者认为，性激素在某些肿瘤的发生及控制过程中，起到相当重要的作用[1]。雌激素可以看作是一种“生长激素”，能使靶器官产生更多的结构蛋白和酶，使细胞增殖和分化。许多作者认为ER、PR的测定结果可视为观察胃肠道肿瘤预后的一个因素，抑癌基因p53（野生型）检测及DNA倍体类型分析对预后判断有重要意义。本研究通过检测结直肠癌组织ER、PR表达和p53及DNA倍体的状况，探讨它们与结直肠癌发生的内在联系及其在临床中的实际应用价值。

    1  对象与方法

    1.1  对象  标本取自2001年3月至2006年3月在我院接受结直肠癌手术治疗的286例患者。所有标本都经病理证实为结直肠癌并完成ER、PR、p53及DNA倍体检测。本组286例,男191例，女95例；年龄18～84岁，中位年龄52岁；Dukes A期38例，Dukes B期133例，Dukes C期89例，DukesD期26例；右半结肠癌79例，左半结肠癌52例，直肠癌155例；高分化腺癌87例，中分化腺癌153例，低分化腺癌46例；术后随访246例（86%），随访时间6～60个月，中位随访时间42个月；其中3年生存率为65.9%，5年生存率为40.5％，死亡49例（死亡率17.1％，Dukes B期6例，Dukes C期20例，Dukes D期23例），将失访的40例归于死亡组，总死亡率为31.1％。

    1.2  方法

    1.2.1  标本收集  标本离体后，即对标本进行解剖，用生理盐水冲洗干净后，取约1 cm×1 cm×1 cm大小的肿瘤组织，另在距肿瘤约10 cm的部位取约1 cm×1 cm×1 cm的结直肠黏膜组织（病理证实为正常组织），置于－4℃环境下保存，待检测。

    1.2.2  试剂  配体：3H－雌二醇，活度3.19 TBq/mmoL，纯度>95%,(H－孕酮，活度2.80 TBq/mmoL，纯度>95%,New England Nuclear center产品。缓冲液：TEDGM、STM。

    1.2.3  受体蛋白的制备  将标本组织剪碎，加TEDGM 缓冲液，高速细胞分散器匀浆，770 r/min 4℃离心10 min ，其上清30000 r/min离心40 min后所得上清为胞浆，其内含胞浆受体蛋白；首次离心后的沉淀用STM 悬浮，细胞用尼龙网过滤，770 r/min离心10 min ，重复3 次，所得沉淀加STM 成胞核悬液，其内含胞核受体蛋白。

    1.2.4  ER和PR的检测 胞浆及胞核ER和PR的测定均采用RBA法，样品用水浴（37℃）保温15 min ，胞浆受体分析采用Dcc(dextran?coated Charcoal technique）法（1％活性碳，0.1％葡聚糖，TEDGM缓冲液）。胞核受体采用滤膜法，滤膜采用3层9999型玻璃纤维滤纸（上海红光造纸厂）。滤膜烘干后用液体闪烁计数仪测量其放射性，将测得的合值减去非特异结合值即得特异结合值，蛋白浓度按Lowry 方法[5]测定。

    1.2.5  p53的检测  p53抗体及免疫组化检测试剂盒（北京中山生物公司）；按结直肠癌细胞p53免疫组化检测按说明书操作。

    1.2.6  流式DNA倍体分析  组织标本室温下解冻，在PBS液中用机械法制成细胞悬液，经180目钢网过滤清除残渣，PBS液洗2遍后70％冷乙醇固定，4℃保存过夜。上机前PBS液洗2遍，制成浓度为1×106/mL的细胞悬液，PI染色30 min，经300目尼龙网过滤后上机检测。用人外周血淋巴细胞作流式细胞仪的校准和外参。采用美国Coulter公司Profile Ⅱ型流式细胞仪，Muticycle专业软件分析结果，依据DNA指数(DI)判定肿瘤细胞倍性状态，DI=1.0±0.05为二倍体，超过此范围为异倍体。

    1.2.7  统计学方法所有统计应用SPSS11.0统计软件统计。两组间差异应用t检验、多组间差异应用方差分析及两组间相关应用相关分析，相关分析用Spearmen相关分析。取P＜0.05 有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  ER和PR在结直肠癌组织中的表达  ER和PR 主要在癌细胞核表达，ER和PR的表达随肿瘤浸润深度增加而减少，随肿瘤分化程度降低而减少。ER和PR的表达水平及其与临床和病理之间的关系见表1。表1  ER和PR的表达水平与临床、病理之间的关系

    2.2  p53基因检测和ER和PR的表达与结直肠癌临床生物学行为和预后的关系  p53基因检测和ER和PR的表达结果显示，p53基因检测Dukes A期突变为12%、DukesB期突变为22%、Dukes C期突变为29%。p53基因检测和ER和PR 的表达水平与结直肠癌患者肿瘤部位、大体类型等无明显相关性（r<0.4,P>0.05）,但与Dukes分期、组织学类型有关，Dukes分期越低，组织分化越低，p53基因检测率越低和ER和PR 的表达水平越低（r>0.56,P<0.01）有明显相关性。

    2.3  结直肠癌DNA 倍体类型与病理分类的关系  286 例中Dukes A期DNA异倍体率明显低于C期（P<0.01)；高分化、中分化腺癌的异倍体率明显低于低分化腺癌；淋巴结转移组的异倍体率显著高于无淋巴结转移组(P<0.01),异倍体生存率明显低于二倍体（P<0.01)（表2）。  表2  DNA倍体类型与病理分类的关系

    2.4  DNA倍体、p53基因检测和ER、PR的表达水平对结直肠癌患者生存率的影响  本组患者行根治性术后3年生存率为65.9%，5年生存率目前为40.5％。利用回归分析进行多因素生存分析表明，DNA倍体分析、p53基因检测和ER、PR的表达水平与结、直肠癌患者预后均有明显相关，差异有极显著性意义（P<0.01）。DNA二倍体、p53基因检测率越高和ER、PR的表达水平越低其患者预后越好；相反则患者预后越差。

    3  讨  论

    自20世纪70年代以来有报道人结直肠癌组织中存在ER、PR，此后，ER、PR在结直肠癌组织的表达及其临床生物学意义日益受到人们的关注[2]。一些流行病学资料显示结直肠癌和乳腺癌发病有相关性，Nanda报道应用抑制雌激素（单用或联用孕激素）替代疗法估计可减少绝经期妇女患结肠癌的风险30％～40％。另有研究报道应用抑制雌激素替代疗法对结肠癌有保护效应。Harrison等报道生理剂量的雌激素可以促进人结直肠癌细胞株的生长，用他莫昔芬后可以抑制其生长。这些研究表明结直肠癌与雌激素密切相关。本研究应用RBA法定量测定286例结直肠癌组织及正常组织的ER、PR，结果示286例标本的结直肠癌组织及正常结直肠组织都可表达ER、PR；但正常结直肠组织表达低呈弱阳性而结直肠癌组织ER、PR表达明显高于正常组织，胞核ER、PR的表达高于胞浆，P＜0.05。表明结直肠癌组织表达ER、PR，且主要在胞核中表达，这与很多免疫组化法的结果相似，且符合甾体激素作用的“二步机制”学说[3,4]，即甾体激素通过扩散方式穿过细胞膜进入胞浆，与胞浆内特异性受体蛋白结合，形成激素受体复合物，然后依赖温度的变构很快移位于细胞核内与染色质结合从而影响DNA转录，产生新的mRNA，在基因水平上调节大分子合成，最终发挥一系列相应的生物效应。

    结直肠癌传统概念属于非激素依赖性肿瘤[5]，故对其组织中ER、PR存在的意义，目前的认识尚不一致[6]。就雌激素与结直肠癌的关系而言，肿瘤组织内雌激素受体存在与否是判断该肿瘤对雌激素依赖的关键，若结直肠癌组织中存在雌激素受体，则说明该肿瘤有雌激素依赖性，应用内分泌就有可能抑制它的。本组资料显示，结直肠癌组织确有ER、PR的阳性表达，这一结果支持结直肠癌具有激素依赖性的观点。大多数学者认为，ER、PR的阳性表达与结直肠癌患者的性别、年龄及肿瘤发生部位无相关性，本实验结果亦证实了这一点。实验中已知ER、PR的阳性表达并非结直肠癌组织所特有，并且在部分正常的结直肠组织中亦有ER、PR的阳性表达，但正常结直肠组织表达程度低呈弱阳性表现，故其对结直肠癌的诊断意义有限。然而ER、PR与结直肠癌病特点的关系一直是大家感兴趣的问题。本文研究表明，ER、PR的阳性表达与肿瘤浸润深度及分化程度有相关性。肿瘤生长于浆膜层内者ER、PR阳性率比肿瘤已浸润至浆膜层外者高，高、中分化腺癌者ER、PR阳性率比低分化腺癌者高，ER、PR的表达从高降低，说明肿瘤细胞脱离了激素依赖性，肿瘤不容易控制，同样预后不佳。说明ER、PR阳性的结直肠癌可能有较好的生物学行为。我们认为，ER、PR是结直肠细胞分化的一种标志，在肿瘤的发生发展过程中，由于肿瘤细胞在遗传上的不稳定性，必然造成异质性，那些去分化明显、有较高侵袭性的肿瘤细胞克隆取代分化较好，较低侵袭性的细胞。因此，ER、PR可以作为肿瘤分化程度及判断预后情况的一个客观指标。p53基因是多种恶性肿瘤中十分常见的共同基因损伤靶位，野生型p53基因在维持细胞正常生长,抑制恶性肿瘤增殖过程中起重要作用。发生突变时转变为突变型p53，其纯合子和半纯合子失去了细胞生长抑制功能而使细胞癌变。p53基因异常与人类肿瘤特别是结直肠癌、乳腺癌的发生发展有密切关系。约50%的结直肠癌发生p53基因突变,染色体在5q和17P等位基因的丢失在25%～70%之间。文献报道，直接对DNA或cDNA分析发现，98%的结直肠癌患者p53基因突变[7]。本组p53基因突变率为63%。p53基因过度表达者生存期延长,尤其在远端结直肠癌和DukesB、C期患者中更明显。研究证实p53基因过度表达者预后好。因此,p53基因检测对判断预后有重要意义。我们认为，在临床上ER、PR、p53可作为观察结直肠癌患者预后的重要指标。结直肠癌组织中ER、PR的存在，说明其细胞对激素的刺激会有一定的反应，也是内分泌治疗有效的基础。ER对雌激素具有高亲和性和专一性，可被类似物竞争抑制。因此，结直肠癌ER、PR测定的意义不在于辅助诊断，而在于判断肿瘤是否有激素依赖性和预后，并且为内分泌治疗提供依据。

    DNA倍体异常可能在结直肠癌发生发展中起重要的作用。大多数研究显示17p、18q上等位基因缺失和p53基因突变[8,9]。临床上即使Dukes分期相同的肿瘤，由于肿瘤的生物学行为不尽相同，其预后仍有较大差异。流式细胞术DNA倍体分析已广泛用于结直肠患者预后的判断，虽然其预后价值尚不能肯定，但大多数研究者认为DNA二倍体肿瘤患者较异倍体患者有较好的生存期[9,10]。我们研究分析了我院286例根治性手术患者的DNA倍体与预后的关系，全组中位随访时间42个月，DNA异倍体肿瘤患者术后总生存率明显低于二倍体患者（P＜0.01），淋巴结（+）异倍体增加，提示DNA异倍体与结直肠癌不良预后有关。

    本研究结果表明结直肠癌组织ER、PR表达高于正常组织，提示结直肠癌组织中ER、PR具有活性；结直肠癌的预后与p53基因突变，DNA二倍体密切相关。DNA二倍体、p53基因检测越高其患者预后越好；ER、PR的表达水平越强说明肿瘤与激素依赖性越强，肿瘤的生物学行为较好。本研究结果为进一步开展结直肠癌内分泌治疗提供理论依据。对于ER、PR在结直肠癌发生、发展过程中的作用及机制，尚需用基因敲除等技术进一步深入研究阐明。

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