枯腐林木暗色丝孢真菌分类鉴定方法评述

　　2.4.2随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)方法。RAPD法是一项检测DNA多态性的分子标记技术。它将通常PCR反应中使用的2个特定序列的引物改为单一的由10个碱基构成的随机引物,并运用大量的不同序列的随机引物进行扩增,扩增的产物通过凝胶电泳显示DNA片段的数量和大小,可以比较菌株之间的基因差异。RAPD技术具有操作简便、灵敏度高、提供的数据信息量大、无放射性污染的特点,目前已被广泛应用于分子生物学研究的各个方面。RAPD技术适合于遗传背景不清的靶基因的分析,适用于种及种以下水平的分类。郑服丛等[19]对柑桔褐腐疫霉(Phytophthora citrophthora)和芋疫霉(P. colocasiao)的16个菌株进行RAPD分析,试验证明,通过RAPD分析得到的分类结果与传统的形态学分类结果一致。同时证明RAPD对于疫霉菌具有属级分类学意义。陈永青等[20]对18种拟茎点霉共29个菌株进行RAPD分析,分析结果也与形态学分类结果一致。据不完全统计,迄今为止,RAPD技术已在链格孢属(Alternaria)、葡萄孢属(Botrytls)、芽枝霉属(Cladosporium)、拟茎点霉(Phomopsis)、茎点霉属(Phoma)、镰刀菌属(Fusarium)等50余个属[18]的种级和种级以下单元的区分中得到应用,被认为是一项成熟而有效的技术。
　　2.4.3DNA指纹技术。近年来,DNA指纹技术广泛应用于真菌分类。染色体DNA限制性片段长度多态性分析(RFLP)则成为在种群、种、种内水平进行分类研究的有效手段。该技术具有以下优点:一是在多种真菌的各类DNA中普遍存在;二是能稳定遗传,且杂合子呈共显性遗传;三是只要有探针就可检测不同物种的同源DNA分子的RFLP;四是限制性内切酶的种类很多,可选择各种不同的限制性内切酶使RFLP充分表现出来。这些特点使RFLP技术常用于真菌的系统演化分析、分类、疑难种的鉴定和种群分析等,成为一种检测真菌种级和种下分类单元的有效方法。Farmer等[21]用7种限制性内切酶对67种外生菌根菌ITS区段做了RFLP图谱分析,结果与形态学鉴别结果一致。Kwasna等[22]利用形态特征和RFLP图谱分析相结合鉴定将P. virgatum sp. nov.与P. daleae区分开来。
　　2.4.4核酸序列分析方法。核酸序列分析技术是目前研究分子进化和系统发育最可靠有效的方法,2种真菌共有的多核苷酸的相同序列越多,同源性越高,可从属及属以上、种、亚种、变种甚至菌株的水平上鉴定枯腐林木暗色丝孢真菌。李河等[23]对从油茶叶上分离得到的一个菌株,结合形态鉴定及rDNA的转录间隔区(ITS)序列的测定,并与GenBank中同源性较高的菌株构建系统发育树,最后确定该菌株为拟盘多毛孢属菌。陈庆河等[24]福建省龙海大豆根上分离得到6个疫霉菌株,在进行形态鉴定、确定致病性与寄主范围后,对其进行了核糖体DNA-ITS序列分析,分离菌株与GenBank中大豆疫霉的ITS序列仅有2个碱基的差异,同源性高达99.8%,据此将这些病原菌鉴定为Phytophthora sojac。18 S rDNA与ITS在真菌的分类鉴定方面各有优点和局限性,故有一定的适用范围,应根据研究目的、对象和现有的试验条件客观地选择。
　　3结语
　　真菌分类是随着其他学科的发展而发展的,从形态分类到现在越来越多被应用的分子生物学方法,其分类的结果也越来越接近自然,更符合生物系统发育的结果。但仅用分子生物学方法建立一套新的真菌分类系统也不能解决真菌分类中的一切问题。现代真菌分类学的基础还是真菌形态学,用分子生物学性状可以验证形态学特征的可靠性,增加人们对形态学性状进化的了解,二者是辨证统一的关系。
　　枯腐林木基质上的真菌资源十分丰富,而我国的研究相对落后。充分挖掘其属、种资源,探索其分类标准,纠正或完善现有属、种分类的混乱,为深入开展丝孢真菌分类研究提供技术积累与经验借鉴,对拓宽认识和发掘真菌资源的基质范围,丰富我国的物种资源,保护生物多样性,推动该类群真菌的系统分类及其在生态系统中作用的研究,均具有重要的科学意义。
　　
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