超临界流体萃取技术在中草药及天然产物提取中的应用*
来源：岁月联盟
时间：2010-07-11
【关键词】 超临界流体萃取；中草药；天然产物；综述
【Abstract】 In the past decade， supercritical fluid extraction(SFE) technology has been successfully applied to the extraction and separation of a variety of active compounds from herbs and natural plants. This paper reviewed a few aspects of SFE application in selection of modifiers， sample preparation， effects of pressure and temperature， collection methods.
【Key words】 supercritical fluid extraction； herbal； natural product；review
中草药及天然产物中有效成分的提取， 直接关系到产品有效成分的含量，影响其内在质量、临床疗效、效益及GMP的实施［1］。传统提取中草药有效成分的方法有水蒸气蒸馏法、减压蒸馏法、溶剂萃取法等，这些方法通常是工艺复杂、耗时、产品纯度不高、对环境污染大，而且易残留有害物质。所以科研工作者们一直在试图寻找提取效率高、选择性好、污染小的方法，随着技术的不断，涌现出了许多新的分离提取方法，加快了提取过程，提高了提取效率。超临界流体萃取技术就是其中之一，较传统提取方法而言，该方法具有简便、快速、提取率高、无污染等特点。
早在1879年，Hannay等［2］就发现超临界乙醇流体对无机盐固体具有显著的溶解能力，但超临界流体萃取(supercritical gluid extraction，SFE)却是在近30年来才迅速发展起来的一种新型物质分离、精制技术［3，4］。所谓超临界流体（supercritical fluid， SCF）是指物质处于临界温度和临界压力时，成为单一相态，即超临界流体，在超临界状态下，流体的性质介于气体和液体之间，既具有与气体接近的粘度及高的扩散系数，又具有与液体相近的密度。在超临界点附近压力和温度的微小变化都可以引起流体密度很大的变化，并相应地表现为溶解度的变化， 因此可以利用温度和压力的变化来实现萃取和分离的过程。超临界流体萃取技术具有萃取速度快、提取率高、产品纯度好、流程简单、能耗低、过程无有机溶剂残留等优点［5］。目前超临界流体研究范围涉及食品、香料、医药、化工、环保等领域［6～14］，并取得了一系列的研究进展。本文就超临界流体萃取技术在中草药及天然产物中有效成分的分离提取中实际操作方面的几个问题进行综述，包括样品的制备、提携剂的选择、萃取温度和压力的影响、萃取产物的采集方法等。
1 超临界流体萃取技术的主要特点［14～24］
1.1 超临界流体的特点 超临界流体既具有液体对溶质有比较大溶解度的特点，又具有气体易于扩散和运动的特性，传质速率大大高于液相过程(超临界流体的扩散系数为～10-4cm2/s，液体的扩散系数为～10-5 cm2/s)。也就是说超临界流体兼具气体和液体的性质，即具有较低的粘度和较高的扩散力。所以超临界流体萃取率高，萃取速度快。
1.2 萃取和分离合二为一 当饱含溶解物的超临界流体流经分离器时，由于压力下降使得流体与萃取物迅速成为两相（气液分离）而立即分开，不存在物料的相变过程，无需回收溶剂，操作方便；不仅萃取效率高，而且能耗较少，节约成本。
1.3 超临界流体萃取通常在较低温度下进行 可以有效地防止热敏性成分的氧化和逸散，特别适合于那些对热敏感性强、容易氧化分解成分的分离提取。
1.4 超临界二氧化碳流体常态下是气体， 无毒 与萃取成分分离后， 完全没有溶剂的残留， 有效地解决了传统提取方法的溶剂残留问题。
1.5 流体的溶解能力与其密度的大小相关 而温度、压力的微小变化都会引起流体密度的大幅度变化， 并相应地表现为溶解度的变化。因此，可以利用压力、温度的变化来实现萃取和分离的过程。
1.6 提取速度快、生产周期短 超临界二氧化碳提取（动态）循环一开始，分离便开始进行。一般提取10min便有成分分离析出，2～4h便可完全提取。同时它无需浓缩等步骤，即便加入提携剂，也可通过分离功能除去。
1.7 分离工艺流程简单 超临界萃取只由萃取器和分离器2部分组成，不需要溶剂回收设备，操作方便，节省劳动力和大量有机溶剂，减小污染。而且操作参数容易控制，因此，有效成分及产品质量稳定可控。
1.8 超临界二氧化碳流体萃取能应用到不同类型的系统中［33］ 如： 分析型设备（萃取釜容积一般在500ml以下），中试设备（1～20L），以及化生产装置（萃取釜容积50L至数立方米）等。
2 超临界二氧化碳流体萃取流体
虽然超临界流体的溶剂效应普遍存在，但实际上需要考虑溶解度、选择性、临界点数据以及化学反应的可能性等一系列因素，因而上常采用的临界点流体溶剂并不太多［24］，而以二氧化碳应用最广泛，因为二氧化碳超临界密度大，溶解能力强，传质速率高；临界压力（7.39MPa）适中，临界温度31.06℃，分离过程可在接近室温条件下进行；便宜易得，无毒，惰性以及极易从萃取产物中分离出来等一系列优点，当前绝大部分超临界流体萃取都以二氧化碳为溶剂。由于二氧化碳是一种非极性溶剂，所以二氧化碳流体最适合萃取亲脂性的化合物。
对于极性化合物的萃取，通常选用极性较强的流体物质，如： CHClF2 (Freon-22) 和NO2［25～29］。但是由于NO2流体容易产生爆炸，CHClF2破坏大气的臭氧层，极大地限制了两种流体的应用。
水也可作为超临界流体材料（水的临界温度为374.2℃，临界压力为22MPa）［30～35］，虽然它对极性化合物有较高的萃取率，但是由于需要较高的温度，所以不适合萃取那些对热敏感性强、容易分解的物质，而且在高温条件下水中的氧有腐蚀性，不仅使有机成分分解，而且可能破坏萃取罐。 所以超临界水流体在实际应用中有很大的局限性。
本文主要讨论超临界二氧化碳流体的应用，其他的超临界流体在这里不做讨论。
3 提携剂
在超临界流体萃取过程中， 由于二氧化碳是非极性物质，比较适合于脂溶性物质的萃取，但对极性较强的物质来说， 其溶解能力明显不足，此时， 为增加二氧化碳流体的溶解性能，通常在其中加入少量极性溶剂，以增加其溶解能力， 这种溶剂称为提携剂（entrainer），也称夹带剂或修饰剂(cosolvent， modifier)。提携剂通常是有机溶剂，它可以是某一种纯物质，也可以是两种或多种物质的混合物。提携剂的加入可以大大提高难溶化合物的溶解度，提高萃取效率，降低萃取时间，但是其作用机制至今仍不清楚，可能是由于提携剂与溶质分子之间的范德华作用力，或与溶质之间形成氢键及其他各种化学作用力等影响了溶质在超临界流体中的溶解度与选择性；另外，在溶剂的临界点附近，溶质溶解度对温度、压力的变化最为敏感，加入提携剂后，混合溶剂的临界点相应改变，如能更接近萃取温度，则可增加溶解度对温度、压力的敏感程度［36～38］。
Hawthorne等［39］使用超临界二氧化碳流体萃取薄荷和青兰中的精油时，在500g的样品中只加入了0.5ml的CH2Cl2，萃取时间就由90min 降低到30min，而萃取率与采用水蒸气蒸馏法提取4h的结果一致； Lin等［40］萃取黄芩根中极性比较大的黄酮类化合物时，加入浓度为70%的乙醇后，提取率比常规方法提高了12.6% ；姜继祖等［41］采用超临界二氧化碳流体萃取光菇子中秋水仙碱时，加入浓度为76％的乙醇做提携剂，结果萃取率提高了1.25倍。
据文献报道，在天然植物的提取中，至少使用过17种提携剂［42］，有水、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯等，其中， 乙醇是最常用的一种，虽然乙醇的极性不如甲醇，但是由于乙醇无毒且易与二氧化碳混合，所以在天然植物的超临界二氧化碳流体萃取中，广泛采用乙醇做提携剂［43～51］。水也可以做提携剂，Ling［52］和Saldana等［53］在研究中发现，样品中含有约10% 的湿度时，可以大大提高萃取率；Miyachi 等［54］用水做提携剂，成功地萃取了木酚素和黄酮类化合物。实验还发现， 水和甲醇及水和乙醇的混合溶液做提携剂时， 比单纯用甲醇和乙醇的效果好，可能是由于水能增加提携剂的极性，更有利于极性化合物的提取，Lin等［40］在提取黄芩根中的黄酮时发现， 使用70%的甲醇作提携剂时， 其萃取率比纯甲醇作提携剂高1倍；笔者［55］采用超临界二氧化碳流体萃取朝鲜淫羊藿中的总黄酮时，也发现用70％的乙醇做提携剂时其萃取效果比用纯乙醇高；Anu［56］和Janicot 等［57］在超临界二氧化碳流体萃取的研究中也证实了这一点。
此外，在超临界流体萃取过程中，还可以根据需要采用不同的提携剂进行分步萃取，可以得到不同的产物，Palma 等［58］用超临界流体萃取葡萄籽中的酚类化合物时就采取2步萃取，首先采用纯二氧化碳作为超临界流体进行萃取时， 主要得到脂肪酸、脂肪族醛类和甾酮类化合物，然后再采用甲醇做提携剂进行萃取， 主要得到表儿茶酸和五倍子酸；Sargenti等［59］用超临界二氧化碳流体萃取柠檬草时，采用3步萃取，分别加入正己烷、丙酮、甲醇做提携剂，得到不同的产物。总之，采用何种提携剂主要取决于样品及产物的性质，并通过初步试验确定最佳提携剂［60，61］。
虽然加入提携剂能够在一定程度上提高萃取率，但是同时也萃取出了更多的杂质，使选择性降低［62，63］。此外， 如果提携剂的浓度不合适，反而会降低萃取率，Sanagi 等［64］采用超临界二氧化碳流体萃取可可豆中吡嗪，实验结果表明， 当采用2%甲醇和5%二氯甲烷做提携剂时，萃取率升高，而采用5%甲醇和2%二氯甲烷做提携剂时，萃取率反而下降。事实上，并不是所有的超临界二氧化碳流体萃取 过程都需要提携剂，Ashraf-Khorassani 等［65］从醉椒根中萃取了7种内酯，用纯二氧化碳流体时萃取率基本上都超过90%，加入乙醇做提携剂萃取率没有显著提高。据报道甚至三萜类化合物在比较温和的超临界二氧化碳流体萃取条件下，当无提携剂存在时，也能获得比较满意的萃取率［66］。
提携剂的加入方式通常有3种［54，60，64，67］：(1)是萃取前将提携剂直接注入到样品基质中，这种方法是最简单、最经济的方法，但重现性差，是目前最简单的近似评价不同提携剂的方法；(2)是将提携剂与液体二氧化碳在钢瓶中预混；(3)是用另一泵注入提携剂，该方法准确度高、重现性好。
4 样品的制备
样品颗粒的大小及湿度情况是影响超临界萃取过程的重要因素。
如果样品颗粒大，流体渗透速度慢，则萃取时间将延长。Reverchon等［67］在罗勒叶的超临界二氧化碳流体萃取中发现，研磨成粉的样品(其粒度在0.17mm左右)，2h就可萃取完全，而样品颗粒为0.55mm时，萃取5h仍然得不到满意的萃取率。所以颗粒小的样品能加快萃取速度，提高萃取率［68］，但如果颗粒过细则影响流体的正常流速，此时，可通过在样品中填充玻璃珠、沙子等解决这一问题［69～71］，其作用是这些沙粒可以防止样品被挤压成结实的、不能渗透的硬塞，从而保持流体在样品中的正常渗透［69，70］。此外，在超临界二氧化碳流体萃取槽入口的末端安装一个金属过滤器，也有助于保持流体稳定的流速，避免形成流体沟［70］。
在中草药及天然产物的超临界萃取过程中，当萃取产物挥发性很强或非常不稳定时，萃取时需要新鲜的样品，此时， 样品的湿度比较大，在萃取过程中水分容易形成冰堵塞限流器。Lehotay［72］报道，当大约0.3% 的水溶解在超临界二氧化碳流体中，萃取率可明显提高，而过量的水留在萃取缸中，会使一些易溶于水的物质进入水相，使萃取率降低。除去水的最简单有效的方法是加入无水Na2SO4，因为无水Na2SO4既能使流体和样品有效的接触提高萃取率，又能吸收一定的水分，保留有效的湿度［73］。Polesello［22］和Lang等［74］还发现，在样品中加入硅胶也可以很好地除去水分。Miller等［72］用硅藻土与含水样品混合制成颗粒，也能有效的吸收水分。适当加热限流器，也是有效地解决堵塞的方法［39，48］。此外，加入提携剂也是一个简单而有效地解决堵塞的方法［75］，Weathers 等［75］在用超临界二氧化碳流体萃取湿红辣椒中的β-胡萝卜素时，加入的2，2-二甲氧基丙烷，不但是提携剂，又起到了干燥剂的作用。Heaton等［76］用超临界二氧化碳流体萃取紫杉中的紫杉烷类成分时，发现当提携剂甲醇的浓度超过5%时，限流器就不容易被石蜡等物质堵塞。
超临界二氧化碳流体萃取经常选用干燥的样品，样品的干燥过程影响萃取的产率和质量。根据文献报道，主要有如下几种干燥方式［45，46，60，70，77～80］：冷冻干燥、烘箱干燥、真空旋转蒸发干燥、干燥等。可根据样品及萃取产物的性质选择合适的干燥方法。
5 压力与温度在超临界二氧化碳流体萃取中的作用
在超临界萃取过程中，压力和温度是两个最重要的物理参数，因为流体密度是压力和温度的函数，而流体密度决定物质的溶解度，进而影响超临界二氧化碳流体萃取的萃取率［47～81］。同时还应该着重指出的是，物质在超临界流体中的溶解度由两个因素决定，即物质的挥发性（是温度的函数）和流体的溶剂化效应（是流体密度的函数）［47］。在超临界区域，流体密度可以在很宽的范围内变化，即压力或温度的微小变化，均可以大幅度改变流体密度。
温度一定时，萃取压力越高，流体的密度越大，对溶质的溶解力越强， 但是过高的萃取压力会受到设备的限制。极性官能团（如羟基官能团）的数量影响溶质的溶解度，需要较高的萃取压力。Stahl 等［82］的实验结果表明， 在压力低于300bar时，可以选择性地萃取含有3个羟基的类固醇，但对含有4个羟基的类固醇，或含有3个羟基1个羧基的类固醇及含有1个酚羟基和2个其他羟基的类固醇却无法萃取出来。Weathers等［76］在萃取辣椒粉中的β-胡萝卜素时观察到，当压力从338bar降到250bar时，相应的流体密度降低，萃取率急剧下降。采用超临界萃取五味子中的木酚素时，Choi等［83］发现，如果萃取时间足够长（30min/100mg样品），温度（40～80℃）和压力(135～340bar)对木酚素的萃取率没有明显的影响，但是如果萃取6min，则增大压力能显著提高萃取率。
为了在超临界二氧化碳流体萃取过程中得到较好的选择性，流体密度是至关重要的参数。Gawdzik 等［84］在实验中发现，在60℃最佳温度条件下，流体密度控制在0.3g/ml时，萃取物几乎都是所需要的化合物。萃取挥发性化合物时如果压力过大，流体密度超过0.80g/ml容易导致甘油三酸酯萃取出来，不但影响萃取物的纯度，而且容易造成限流器堵塞［71，85］。Chouchi等［86］在对橙皮进行超临界二氧化碳流体萃取时，确定了最佳实验条件为40℃、77bar（二氧化碳流体密度为0.25g/ml），并且在实验中发现高流体密度会降低萃取的选择性。超临界二氧化碳流体萃取迷迭香、罗勒属及牛至属叶中的精油，最佳萃取条件是温度为40～50℃，压力为80～100bar［67］。
通过控制压力，即改变流体密度，可以分馏得到不同的产物。Ibanez等［77］用两步超临界二氧化碳流体萃取法， 从迷迭香叶中分别得到精油和抗氧化成分，完成第一步的萃取条件是40℃、100bar，第二步萃取是在60℃、400bar的条件下进行的。采用不同流体密度还可以进一步分离萃取物，提高选择性， Marongiu等［80］用超临界二氧化碳流体萃取几种植物叶中的精油，在压力90bar、温度-5℃时，首先在第一个分离器沉淀出一些石蜡；然后控制压力为15～20bar，温度为15～21℃，在第二分离罐得到挥发油部分。Reverchon 等［67］也采用这种方法将萃取物中的石蜡与精油分开。
如果被萃取物不是易挥发性物质，在超临界二氧化碳流体萃取过程中则需要较高的流体密度。Chun 等［47］用超临界二氧化碳流体萃取紫杉树针时，在300 atm、40℃才能得到需要的产物， 而在100atm、40℃，即较低的流体密度条件下，萃取物只有石蜡。用超临界二氧化碳流体萃取文朵灵生物碱，在最高的流体密度时，得到了最高的提取率。Marleny 等［51］用超临界二氧化碳流体萃取提取二甲麦角新碱时，当温度保持70℃不变，压力由100bar 增加到400bar时，萃取率提高了85倍，如果在较低的温度和压力下，要想得到相同的萃取率，则需要消耗大量的时间和二氧化碳。此外， 在进行秋水仙碱等生物碱萃取时，用3% 甲醇做提携剂，当二氧化碳流体密度由0.8g/ml增加到0.9g/ml (247bar)，各种生物碱萃取率增加2～3倍，而压力不变，温度由35℃升到40℃，各种生物碱的总提取率变化很小［87］。
温度对超临界流体溶解能力的影响比较复杂，压力一定时，随着温度的升高，一方面二氧化碳流体密度降低，导致二氧化碳流体的溶剂化效应下降，使物质在其中的溶解度下降；另一方面物质的蒸气压增大，使物质在二氧化碳流体中的溶解度增大。当前者占主导地位时，溶解度呈下降趋势，后者占主要地位，溶解度呈上升趋势。Lin 等［58］采用超临界二氧化碳流体萃取黄芩根中的黄酮类化合物，加入70%的甲醇做提携剂，当压力恒定时，温度由40℃升高到50℃，提取率增加10%左右，温度由50℃继续升高到60℃，萃取率反而稍微有些下降。Ashraf-Khorassani等［88］和陈钧等［44］在实验中也发现了类似的。Chiu等［50］萃取银杏树中的黄酮类化合物时，发现在一定的压力下（31.2MPa），随着温度的升高，萃取率呈下降趋势。
总之，随着压力的增加二氧化碳流体密度将增大，因而有增加溶解能力的效应，尤其在临界点附近，压力对密度的影响特别明显；与压力相比，温度对二氧化碳流体中溶质溶解度的影响要复杂得多。应当指出，影响超临界二氧化碳流体溶解能力最主要的因素是溶质的性质，这一因素决定该物质能否应用于超临界流体萃取。
6 萃取物的采集方法
在超临界流体萃取中，样品的萃取过程完成后，产物的采集十分重要，如果收集方法不当，会导致被分析物丢失，影响萃取率［89，90］。在天然产物的超临界萃取过程中，常用的采集方法有：溶剂采集法、固相采集法和在线采集法。
溶剂采集法就是在采集的容器中装有液体溶剂，在溶剂中收集产物，这是最常用也是最简便的方法，产物通过限流器出口流入到装有少量有机溶剂的容器中，常用的有机溶剂有甲醇［46，40，60，79］、丙酮［91］、乙酸乙酯［73， 92］、正己烷-甲醇［63］ 、二氯甲烷［39，71］等等。Sanagi 等［64］发现，采集挥发性化合物时，在冷却条件下，采用不同的有机溶剂，萃取率不同，如-8℃时，用二氯甲烷和丙酮做采集溶剂所得萃取率比甲醇和正己烷高。Smith等［101］认为，用甲醇-冰（-15℃）和丙酮-冰（-60℃）做冷阱采集挥发性化合物均不如液氮（-170℃）效果好。对于非挥发性萃取物的采集，在室温和低温条件下，都能得到比较满意的产率［45， 71］。应该注意的是，有机溶剂的浓度也可能影响采集效果，相同体积的溶剂在相对窄口瓶中比宽口瓶中采集结果更好［64］。
