液相联用研究IS-5-MN缓释胶囊人体生物等效性
摘要：18名健康受试者随机交叉给药，分别单次（40mg）及多次口服国产5-单硝酸异山梨醇酯缓释胶囊和迸口缓释胶囊进行人体生物等效性研究。采用液相色谱/质谱联用测定血浆中IS-5-MN的的浓度，经数据处理，单次口服国产和进口5-单硝酸异山梨醇酯缓释胶囊的：AUC0-36分分别为7490.65±1144.06μg·h/L和7355.38±1007.36μg·h/L，Tpeak分别为4.92±1.31h和4.67±O.79h，Cmax分别为519.15±60.53μg/L和523.67±68.99μg/L；多次口服达稳态时：AUC0-36分别为8514.11±1318.07μg·h·L-1和8586.87±836.38μg·h·L-1，Tpeak分别为4.83±0.94h4.75±1.14h，Cmax分别为570.44±78.89μg·L-1和580.43±64.04μg·L-1，波动系数FI分别为135.10±15.53%和134.82±9.71%。对单次及多次给药所得梯形法的两者的AUC0-36，Cmax、Tdeak进行方差分析和双单车侧检验结果表明两者具有生物等效性。国产5-单硝酸异山梨醇酯缓释胶囊单次给药及多次给药稳态时的相对生物利用度分别为101.9±7.3%和99.1±11.9%。
关键词：IS-5-MN HPLC/MS 生物等效性
5-单硝酸异山梨醇酯（isosorbide 5-mononitrate，IS-5-MN）是硝酸异山梨醇酯（isosorbidedinitrate，ISDN）主要代谢产物之一，其主要药理活性是松弛平滑肌。与硝酸异山梨醇酯相比，IS-5-MN具有吸收迅速、无首过效应、生物利用度高等特点。临床上主要用于预防心绞痛，在对充血性心力衰竭和血管痉挛性心绞痛的方面应用日益广泛。有关IS-5-MN的测定方法的报道都是气相色谱-捕获法或毛细管电泳-电子捕获法测定，本试验建立液相色谱/质谱联用法（LC/MS）测定血浆中IS-5-MN的浓度，并用此方法对国产1S-MN缓释胶囊进行多剂量人体生物等效性研究。现将试验方法与结果报告如下：
材料和方法
1.1 试药及试剂
被试制剂：国产IS-5-MN缓释胶囊，40mg/粒，由北京第二制药厂研制。含量102.6%。批号980103。标准参比制剂：进口IS-5-MN缓释胶囊（商品名：德脉宁），40mg/粒，德国麦克乐制药公司生产的市售产品，合量：102%，批号1924A7。对照品：IS-5-MN，由北京第二制药厂提供，批号980127，含量：99.96%。试剂：甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，浓氨水、乙酸乙酯为分析纯。
1.2 仪器及色谱条件
Waters公司2690型高效液相色谱系统（带自动进样器），Waters公司Platform LCZ质谱检测器，Masslynx工作站。3P97（生物利用度计算程序）由药会数学专业委员会编制。色谱条件：采用Waters C18色谱柱（4μm，150mm×2.Onm）；柱温20℃；流动相：甲醇：氨水溶液（O.03mol·L-1）=20∶80（pH=7.8），流速O.25ml·min-1，进样量20μl。质谱条件：电喷雾电离源（ESI），选择性监测质荷比为（M/Z）190带负电荷的分子离子峰，电喷雾电压3.5KV，干燥气（N2）流速为368L·min-1，干燥气温度为250℃。
1.3 受试者及给药方法
18名健康受试者均为男性，年龄22-23岁，身高165-186cm，体重56-80kg。受试者在试验前进行体格检查．肝肾功能，心率、呼吸、血压及心电图均正常。受试者试验前两周及试验期同未服用其他任何药物。试验前均签署知情同意书。试验方案经卫生部北京伦理委员会批准通过。
采用随机交叉试验方法进行试验设计，单次与多次结合进行，18名受试者随机分成两组，第1天禁食12小寸后清晨8时空腹口服试验药品，其中9名口服被试制剂，9名口服标准参比制剂，剂量均为40mg，用温开水100ml吞服。受试者在服药抽血期间禁姻、酒，服药后2h给予统一低脂肪饮食。血样自给药后1，2，3，4，5，6，8，12，24，36h，取上肢静脉血3ml。
第3天（即48h）晨起8时受试者按前述方案继续服药（每日口服40mg试验药品），连服5天，第4、5、6、7、8天早晨服药前取血浆3ml，供测定谷浓度，以考察是否达到稳态；第8天服药后按第1天采血时间及方法采上肢静脉血3ml。
将血标本置于肝素化的试管中，离心（3000r/min，5min），分离出血浆。-20℃避光保存至测定。第一次试验结束二周后交叉给药重夏实验。整个实验在医生、护士监护下进行。
1.5 血药浓度的测定
1.5.1 标准溶液的配制
精密称取IS-5-MN标准品25.Omg置100ml容量瓶中用流动相溶解并加至刻度成250mg·L-1，取4ml于1OOml容量瓶中用流动相稀释至刻度，使成10mg·L-1标准贮备液待用。
1.5.2 血样的预处理
取血浆1ml置5ml离心管中，加乙酸乙酯1ml，振荡0.5min。离心（3000r·min-1，5min），吸取有机层至另一试管中；同法提取三次，合并三次提取液， 40℃水浴中氮气挥干，用100μ流动相溶解进样。
1.5.4 标准曲线的制备
取空白血浆加人IS-5-MN标准贮备液（10mg/L）适量使成640μg·L-1，再依次稀释成320，160，80，40，20，10μg·L-1系列浓度，按上述方法处理后进样测定。
1.6 方法学评价
1.6.1 萃取回收率的测定
空白血浆中加人IS-5-MN标准贮备液（1Omg·L-1）适量使成的600，200，20μ·L-1三个浓度的样品,按血样处理方法处理后进样，另用流动相配制相应浓度IS-5-MN溶液，不经萃取直接进相同量的样．以此为标准，将两组峰面积进行比较计算IS-5-MN的萃取回收率。
1.6.2 方法回收率及精密度的测定
空白血浆中加人IS-5-MN标准贮备液（1Omg·L-1）适量制成的600，200，20μg·L-1的三个浓度的样品，按血样处理方法处理后进样，各浓度日内重复测定5次，并连续测定5日，计算其方法回收率及日内、日间的精密度。
1.7 数据处理
（1）稳态时Cmax，Tpeak的值均采用实测值。Cmin是用稳态时第8天Oh与24h的浓度的平均值。用梯形法计算AUC0-t。
（2）由药-时曲线末端相血药浓度的对数对时同t回归，求算消除速率常数k及消除半衰期t1/2
（3）AUC0-∞=AUC0-t+c*/k。其中c*为最末取血点浓度，k为消除速率常数。
（4）相对生物利用度（F）按下式计算：
2（Cmax-Cmin）
FI= ————————×100%
（Cmax-Cmin）
（5）波动系数（FI）用下式计算:
AUC0-t（被试制剂）
F=———————————×100%
AUC0-t（标准参比制剂）
（6）直接用3P97程序进行统计分析以考察两种制剂的生物等效性。
试验结果
1.1 色谱图
在选定的条件下测得的质谱色谱图见图１，由图1可见，血浆中IS-5-MN的保留时间为：5.32min。其M/Z为190。
Fig 1.Chromatogram of IS-5-MN in plasma
A plasma sample B Mass spectral of IS-5-mn
1.2 标准曲线回归方程
将标准曲线测定项下测得的峰面积值S对浓度C进行直线回归，得标准曲线回归方程如下。本试验的线性范围：10—640μg·L-1，最低检测浓度为7.5μg·L-1。（S/N≥3）
S=57.8273C-345.7710 ｒ=0.9998
1.3 萃取回收率、方法回收率及精密度的测定结果：见下表2，IS-5-MN三个浓度的日内、日间RSD皆小于10%。
Concentrationμg·l-1 | Extraction recovery（%） | Method recovery（%） | Witnin-dayRSD(%) | Betwween-dayRSD(%) |
600 | 86.82 | 100.54 | 2.00 | 2.43 |
1.4 血样测定结果
18名健康受试者单次及多次给药达稳态时的药时曲线见图2、3。此可以看出，健康受试者国产胶囊与进口胶囊所测的所有血浆中药物浓度均在本试验线性范围内
Time(h)
Fig 2 Mean plasma concertation-tine curve of IS-5-MN
after a single oral dose(40mg)
Time(h)
Table 3 Mean plasma concentration-time curves of IS-5-MN
after the last dose of multiple dose (40mg,qd) regimen
1.5 药代动力学研究
18名健康受试者单次及多次口服40mg国产制剂及进口制剂后的药代动力学参数见表2。
dose（40mg）and the last dose of multiple doses
（40mg qd）in 18 volunteers
Parameters | unit | Single oral dose | Multiple orel dose | ||
domestic | imported | domestic | imported | ||
AVC0-24 | (μg·h·L-1) | 7658±1182 | 7699±819 | ||
AUC0-36 | (μg·h·L-1) | 7490±1144 | 7355±1007 | 8514±1318 | 8586±836 |
AUC0-∞ | (μg·h·L-1) | 7777±1077 | 7671±1023 | 8910±1388 | 8934±860 |
Cmax | (μg·L-1) | 519.15±60.53 | 523.67±68.99 | 570.44±78.89 | 580.43±64.04 |
Cmin | (μg·L-1) | 109.35±37.91 | 112.02±15.08 | ||
Tmax | （h） | 4.92±1.31 | 4.67±O.79 | 4.83±0.94 | 4.75±1.14 |
Ke | （h） | 0.099±0.019 | 0.094±0.014 | 0.096±0.017 | 0.096±0.013 |
t1/2ke | （b） | 7.276±1.477 | 7.540±1.055 | 7.433±1.299 | 7.313±1.017 |
MRT0-36 | （h） | 11.099±0.704 | 11.340±0.712 | 11.028±0.899 | 11.021±0.492 |
FI | （％） | 135.10±15.53 | 134.82±9.71 | ||
F | （％） | 101.9±7.3 | 99.1±11.9 | ||
1.6 生物利用度研究
单次给药及多次给药稳态时国产制剂的相对生物利用度为101.9±7.3%和99.1±11.9%，见表2用3p97程序对被试制剂与标准参比制剂进行生物等效性分析。单次给药及多次给药两制剂梯形法汁算的AUC0-36、Cmax、Tpeak经对数转换，方差分析结果、双单侧检验及90%可信限判断的结果见表3，由表3可见，两种制剂具有生物具有生物等效性。
Single oral dose | Multiple oral dose | |||||
T1 | T2 | 90%confidential interval | T1 | T2 | 90%confidential interval | |
InAUC0-t | 11.213 | 9.678 | 97.8-105.7 | 5.554- | 6.417 | 92.0-105.3 |
InCmax | 6.884 | 7.351 | 93.8-105.1 | 7.370 | 8.911 | 93.2-102.9 |
InTpeak | 4.443 | 2.936 | 3.8-ll6.8 | 3.544 | 2.971 | 90.1-115.5 |
讨论
有关IS-5-MN血药家度测定方法国内、外报道均采用气相色谱-捕获法或毛细管电泳-电子捕获法测定[2-4]，本实验建立了高效液相-质谱检测器测定IS-5-MN血浆中药物浓度的方法，具有较高的灵敏度、准确度、专一性，能满足体内低浓度药物研究的需要及药代功力学、生物利用度研究的需要。
因为所研究的药物是缓释制剂，故进行多剂量的药代动力学及生物利用度的研究，上述试验结果表明：国产制剂与进口制剂达稳态后在人体内的吸收、分布、消除性质颇为相似，IS-5-MN有效浓度100μg·L-1，从达稳态的药时曲线看，每日一次，每次40mg可以维持24小时。其药代动力学参数数据与报道较为一致。并用3P97程序对两制剂进行生物等效性的统计分析，即对梯形法的AUC0-36、Cmax、Tpeak进行方差分析和双单侧检验，结果表明：西种制剂在人体内具有生物等效性。
在试验过程中，健康受试者口服40mg国产或进口IS-5-MN缓释胶囊后，所有受试者均出现轻度头痛、失眠现象，随着用药次数的增加，其副作用有所减轻，试验结束停止服药30h后症状自行消失。
