选择性COX-2抑制剂不依赖于COX-2的抗癌作用
【关键词】 COX-2抑制剂；抗癌
近年来，选择性环氧化酶-2（COX-2）抑制剂的抗癌作用是备受关注的一个研究热点。自从塞来考昔于1998年，罗非考昔于1999年进入医药市场以来，超过3000项研究显示了这类药物的分子靶点和临床效益。然而，由于长期使用COX-2抑制剂会增加患心血管疾病的危险，使得这类药物正面临严峻考验。伐地考昔等多种C0X-2抑制剂被FDA勒令回收，目前研究主要集中在塞来考昔和罗非考昔上。大部分的体外试验显示塞来考昔和罗非考昔抑制肿瘤的浓度要比抑制COX-2的活性所需要的浓度高，这说明还存在着不依赖于COX-2的抗癌作用机制，而且在肿瘤的中具有重要的作用。本文主要讨论COX-2抑制剂（主要是塞来考昔和罗非考昔）不依赖于COX-2的抗癌作用机制。一般来说，COX-2抑制剂的抗癌作用机制包括抑制细胞周期进程、诱导凋亡以及抑制血管新生和转移三部分。
1 抑制细胞周期进程
细胞周期各期之间的转变受多种细胞周期蛋白、周期蛋白依赖激酶CDKs和细胞周期抑制蛋白的调控。塞来考昔能使多种肿瘤细胞发生G1 期阻滞，同时伴随着周期蛋白A、B、D 表达减少，细胞周期抑制蛋白p21和p27表达增加，CDK失活。这些改变，在一定程度上是不依赖于COX-2抑制剂的，因为塞来考昔抑制细胞增殖的浓度要高于抑制COX-2活性所需要的浓度；加入PGE2 并不能抵消 该效应，抑制COX-2的活性也不能模拟该效应。 罗非考昔虽然抑制COX-2的效价比塞来考昔高，却不能始终如一的产生类似的效应。
1.1 塞来考昔抑制蛋白激酶B（PKB/Akt）或其上游的磷酸肌醇依赖激酶1（PDK-1） 试管试验的结果表明PDK-1似乎是塞来考昔的一个直接靶点。塞来考昔利用其甲基结构，与ATP竞争结合PDK-1的ATP结合位点，从而抑制PDK-1［1］。有很多研究报导塞来考昔抑制PKB，然而到底是直接作用于PKB还是通过其他靶点如PDK-1的间接作用还不清楚。塞来考昔的类似物4-［5-(2，5-dimethylphenyl)-3(trifluoromethyl)-1H-pyrazol-1-yl］benzene sulfonamide，虽然缺乏抑制COX-2的作用，也能抑制PKB、PDK-1活性［2］。因此，该作用很可能是不依赖于COX-2的。
1.2 塞来考昔抑制多种CDK－周期蛋白复合物 使磷酸化的成神经母细胞瘤减少，细胞周期被阻滞在G1期［4］。然而，对于人脐静脉内皮细胞，多种周期蛋白（如周期蛋白A、B1、D1、E）、周期蛋白依赖的抑制蛋白（p12、p27）和CDKs（CDK1、CDK2、CDK4、CDK6）的表达水平并不受塞来考昔的影响，而塞来考昔也不影响CDK2在苏氨酸－160的磷酸化水平。因此，关于塞来考昔对CDK-周期蛋白复合物的抑制机制仍不清楚。
1.3 塞来考昔提高乳腺癌细胞中神经酰胺的水平 神经酰胺和其他神经鞘脂类都是细胞中重要的信号分子，调节多种细胞进程，包括细胞增殖、衰老、凋亡和细胞周期。神经酰胺能激活压力信号级联放大中的多种酶，包括蛋白激酶（jun激酶，Ras激酶抑制蛋白，蛋白激酶C的多种亚型）和蛋白磷酸酶（蛋白磷酸酶1和蛋白磷酸酶2A）。因此，塞来考昔对神经酰胺浓度的影响可能在塞来考昔诱导的生长抑制中具有一定的作用［4］。
1.4 塞来考昔抑制鸟氨酸脱氢酶的活性 该酶把L-鸟氨酸转换到polyamine putrescine。多胺水平升高能促进细胞增殖，减少凋亡，使影响肿瘤侵袭和转移的基因表达增加。在结肠癌器官中鸟氨酸脱氢酶的活性比正常的结肠上皮组织高10～15 倍［5］。因此，塞来考昔抑制鸟氨酸脱氢酶活性可能与其诱导G1期阻滞有关。
1.5 罗非考昔对细胞周期的调节作用具有争议性 因为罗非考昔对人脐静脉内皮细胞的细胞增殖没有影响，但减少周期蛋白D1的表达，增加周期抑制蛋白p21和p33的表达，增加人胰腺癌细胞生长停滞DNA损伤诱导基因GADD34和GADD45的表达［6］。此外，罗非考昔基本上不抑制PKB的活性［2，7］。
2 诱导凋亡
许多研究表明塞来考昔通过诱导凋亡在多种肿瘤细胞系中发挥抗癌作用［7］。塞来考昔使肿瘤细胞中抗凋亡蛋白Bcl－2、Bcl－xL、Mcl－1和存活素表达下调，而凋亡前体蛋白Bad表达增加［8，12］，线粒体快速释放细胞色素C、Apaf－1和caspases3、8、9活化。塞来考昔还能使人非小细胞肺癌细胞死亡受体DR5表达增加，激活失荣细胞的FAS-FADD死亡途径。然而，并非在所有的细胞试验中都能观测到同样的结果。例如，对于人子宫颈癌细胞系Hela和CaSki，FADD介导的死亡途径并未被诱导［9］。罗非考昔在多种肿瘤细胞系中也能诱导凋亡，但其分子机制尚未见报道。
2.1 塞来考昔诱导凋亡的其中一个靶点是PDK-1或其下游底物PKB/AKT［1～3，7］ PKB通过磷酸化使凋亡前体蛋白BAD失活；或磷酸化procaspase 9 使其不能从活化的caspase 9上清除；又或者磷酸化凋亡信号调节蛋白1，抑制应激活化蛋白激酶信号传导途径以及其他激酶来诱导凋亡。而罗非考昔几乎不抑制PKB活性［2，8，9］，因此PKB并不是罗非考昔诱导凋亡的作用靶点。
2.2 塞来考昔的另一个靶点是神经鞘脂类传导途径 塞来考昔可以增加大鼠乳腺癌细胞66.1的神经酰胺水平［4］。正如前面讨论的，神经酰胺含量的增加与诱导凋亡有关。神经酰胺通过线粒体外膜神经酰胺通道的形成，诱导线粒体释放凋亡前体蛋白，对于凋亡的产生具有重要的调节作用。
2.3 塞来考昔抑制PC-3人前列腺癌细胞内质网Ca2+-ATPase(IC50=35μM)的活性 从而阻止从胞浆中重吸收Ca2＋，使细胞内游离Ca2＋水平上调［10］。这是塞来考昔特有的，并未在其他COX抑制剂中发现，包括罗非考昔。Ca2＋的浓度对于凋亡很关键，可以激活Ca2＋敏感的蛋白酶、核酸内切酶和胱门蛋白酶。此外，打开线粒体通透转化孔，释放细胞色素C，也需要一定浓度的Ca2＋参与。因此，塞来考昔对内质网Ca2+ ATPases的抑制作用可能与其诱导凋亡相关。
2.4 塞来考昔抑制碳酸酐酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、 and Ⅸ的活性 碳酸酐酶Ⅱ－塞来考昔复合物的晶体结构表明，塞来考昔的氨苯磺胺基团结合到碳酸酐酶Ⅱ的催化性锌指结构［11］，而罗非考昔，含有甲基磺基，并不抑制碳酸酐酶活性。碳酸酐酶Ⅱ和Ⅸ在肿瘤的生长和发育过程中具有一定的作用，是多种肿瘤的潜在生物标记物（如结肠直肠癌、胃癌、肾透明细胞癌）。
2.5 肿瘤细胞逃避正常生长调节的其中一个机制是抑制凋亡前体蛋白的产生 如来源于15-lipoxygenase 1信号途径的13-S-hydroxyoctadecadienoic acid (13-S-HODE)。15-lipoxygenase 1的表达及其产物13－3-HODE在人结肠癌、食管癌细胞中均比正常对照组织含量低，在人结肠或食管癌细胞系中加入13－S-HODE可以抑制细胞增殖，诱导凋亡。塞来考昔诱导人结肠癌细胞系RKO凋亡过程中，伴随着15-lipoxygenase 1表达和13－S-HODE生成增加。在RKO细胞中过表达15-lipoxygenase 1的反义结构物则减少13-S-HODE生成，阻碍凋亡。塞来考昔对脂氧酶途径的作用似乎与COX-2无关，因为在C0X低表达的结肠癌细胞系中也能观察到这一现象。对罗非考昔并未进行相关的研究［13］。
2.6 塞来考昔改变核转录因子NF-κB的DNA结合活性 NF-κB在多种肿瘤细胞中表达或过表达。塞来考昔能促使子宫颈癌细胞中NF-κB与DNA结合，诱导凋亡［9］。而对于非小细胞肺癌，塞来考昔抑制由吸烟等化学因素诱导的NF-κB的活化，随后促使参与炎症，细胞增殖和具有致癌作用的多种NF-κB调节基因的表达下调 。
2.7 罗非考昔在多种炎症模型中也能抑制NF-κB的结合活性［14］ 但这一作用是否与其抗癌作用有关尚不清楚。罗非考昔可以增加肿瘤组织中过氧化物酶体增殖子激活受体γ和凋亡前体蛋白Bax及caspasa3的表达，但抗凋亡蛋白Bcl－2 和生存素的表达下调。这一作用的分子靶点还不清楚。大多数研究结果表明罗非考昔对凋亡中多种蛋白的表达水平和活性均无影响。而这与罗非考昔在多种肿瘤细胞中抗癌活性低于塞来考昔的结果是吻合的。
3 抑制血管生成和转移
3.1 塞来考昔抑制大鼠肝细胞瘤细胞早期生长反应因子Egr-1的活性［15］ Egr-1是一种转录因子，对成纤维细胞生长因子和多种参与血管生成及促进肿瘤发育的细胞因子和受体的转录调节有一定影响。因此，塞来考昔抑制Egr-1基因的活化能在一定程度上抵消各种促癌变刺激和抑制血管生成。
3.2 塞来考昔抑制人胰腺癌、乳腺癌细胞中VEGF的表达［16，17］ VEGF的启动子区含有一个Sp1结合位点，对VEGF的表达非常重要。塞来考昔能降低转录因子Sp1的DNA结合活性和转录激活活性，从而导致Sp1蛋白表达和磷酸化减少。罗非考昔也可以降低小鼠结肠直肠癌组织中VEGF的表达，但具体机制还不清楚。
3.3 塞来考昔直接抑制内皮细胞的增殖 这主要依赖于塞来考昔对PKB/AKT和CDKs的抑制，还与RB蛋白的磷酸化减少以及G1期阻滞有关［3］。塞来考昔还能使HUVECs发生凋亡，同时伴随着细胞内Ca2+浓度和caspases活化增加。罗非考昔既不影响HUVECs细胞周期进程，也不诱导凋亡。但也有研究显示罗非考昔抑制皮微血管内皮细胞（HMVECs）脉管形成和细胞迁移。这与降低前血管生成因子、基本成纤维细胞生长因子的表达有关［5］。
3.4 罗非考昔和塞来考昔均影响金属蛋白酶的表达和活性 金属蛋白酶在组织侵袭、转移和血管新生中具有一定的作用。金属蛋白酶2和9 是降解Ⅳ型胶原酶的关键酶。塞来考昔抑制体外培养的肺腺癌细胞金属蛋白酶9的活性，降低成纤维细胞样滑膜细胞金属蛋白酶1－3的分泌［19］。在人成胶质细胞瘤中金属蛋白酶2的表达依赖于PKB的激活，而塞来考昔抑制PKB的磷酸化，从而抑制这些细胞的侵袭［18］。因此，塞来考昔可能通过抑制PKB/AKT发挥抗血管新生和抗侵袭作用。而罗非考昔诱导金属蛋白酶2，COX-2，周期蛋白D1，β-连环蛋白和肿瘤抑制性白介素10的表达；增加抗瘤性白介素12的表达；轻度降低金属蛋白酶9的表达［6］。
4 展望
不同的COX-2抑制剂的抗癌作用有所偏差。Methylcelecoxib（塞来考昔的衍生物，不能抑制COX-2）和塞来考昔，具有较强的抗癌活性；罗非考昔，抗癌作用比较弱；lumiracoxib几乎没有抗增殖活性。目前对这些偏差还缺乏合理的解释，有待进一步研究。虽然所有的COX-2抑制剂都是选择性的COX-2抑制剂，但化学结构不一样。确定塞来考昔和其他COX-2抑制剂不依赖于COX-2的直接靶点，有可能找到其发挥抗癌作用的化学结构，对这些部分进行结构改造或修饰，有可能产生更有潜力的抗癌药物。这些药物可能代表了新一类的化合物，适用于肿瘤的和预防。
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