20%KOH溶甲法诊断甲真菌病与直接镜检、培养和甲病理对照研究
作者 ：李 薇，冉玉平，杜晓萍，代亚玲
【摘要】 目的 提高甲真菌病诊断的准确率和阳性率，探索新的实验方法。方法 对疑为甲真菌病感染者61例采用20%KOH溶甲法从甲标本中检测真菌，并与直接镜检法、真菌培养法和组织病检查进行比较。结果 20%KOH溶甲法检出率86.89%，高于直接镜检法、真菌培养法和组织病理学检查。结论 20%KOH溶甲法是一种检出率高、可行性强的甲真菌病诊断方法。
【关键词】 甲真菌病；诊断
【Abstract】 Objective To improve the rate of accuracy and positiveness in diagnosis of onychomycosis， and to explore new approaches.Methods 61cases of suspected onychomycosis were tested by KOH-treated nail clippings， and compared with direct microscopic examination， fungal culture， histopathologic examination. Results The positive rate of KOH-treated nail clippings was 86.89%， and was also higher than other approaches.Conclusion KOH-treated nail clippings is a reliable method that has proved high positive rate.
【Key words】 onychomycosis；diagnosis
甲真菌病在人群中的发病率为2%～13%［1］，与其他皮肤病如银屑病等从临床上难以区别，甲屑直接镜检和真菌培养是公认诊断甲真菌病的金标准，但受取材的质和量等因素影响，二者结合诊断的阳性率＜70%［2］。近年来开展了剪取病甲做组织病理学检查［3］，使查菌的阳性率得以提高，却存在着制作繁杂、耗时长等缺点，限制了其推广。为了寻求检出率高、可行性强的诊断方法，我们采用20%KOH溶甲法（以下简称溶甲法）从甲标本中检测真菌，并与直接镜检法、真菌培养法（以下简称培养法）和组织病理学检查（以下简称病检法）进行了比较。
1 资料与方法
1.1 一般资料 我科门诊和住院疑为甲真菌病感染者共61例，男24例，女37例，年龄8～70岁，平均34.5岁，病程3个月～40年，平均7.2年。指、趾甲共207个。均在受检前1个月内未接受过局部和系统抗真菌药物。
1.2 标本采集 以75%酒精消毒病甲表面后，用消毒手术刀刮弃表层甲屑，刮和剪取足量甲（屑），分为4份。
1.3 方法和判断标准 4份标本分别按下述4种方法处理。
1.3.1 直接镜检法 取刮下甲屑于载玻片上，加10%KOH 1滴溶解，10min后观察，镜下见菌丝和(或)孢子者为阳性。
1.3.2 培养法 甲（屑）分别接种于以下3种培养基：(1)含氯霉素、放线菌酮的沙堡培养基，25℃～28°C培养；(2)含氯霉素、不含放线菌酮的沙堡培养基，25℃～28°C培养；(3)含菜籽油的沙堡培养基，37°C培养。每管培养基种2～4点，培养4周无菌落生长为阴性；有菌落生长者，据其生长特征以及玻片法或钢圈法培养结构特点做菌种鉴定，必要时做米粉吐温琼脂培养基、尿素酶培养基帮助鉴定。
1.3.3 病检法 (1)剪下的病甲经2.5%戊二醛固定；(2)软化脱钙（脱钙液：盐酸34ml、氯化铝28g、甲酸20ml，蒸馏水400ml）；(3)酒精梯度脱水及氯仿处理（酒精浓度分别为85%、95%、100%）；(4)石蜡包埋、切片；(5)染色、封片镜检（行PAS及六胺银染色）。组织中见到菌丝和(或)孢子者为阳性。
1.3.4 溶甲法 (1)病甲置20%KOH内，56°C水溶30min；(2)生理盐水洗涤溶解物，离心后弃上清液；(3)沉淀物涂片；(4)丙酮固定；(5)Parker墨水染色，封片镜检。观察到菌丝和(或)孢子者为阳性。
2 结果
2.1 直接镜检法 61例拟诊患者甲标本中，真菌阳性者35例（57.38%），见图1。
2.2 培养法 61例拟诊患者甲标本培养出38例40株真菌，单一感染36例（94.74%），混合感染2例（5.26%）。菌种分布情况：33株皮肤癣菌中红色毛癣菌31株，须癣毛癣菌2株，见图2；酵母菌6株中白色念珠菌2株，糠秕马拉色菌3株，念珠地丝菌1株；曲霉属1株。有2例为混合真菌感染，1例为红色毛癣和糠秕马拉色菌，1例为红色毛癣菌和白色念珠菌。
2.3 病检法 46例检出真菌成分。35例直接镜检阳性标本中，34例检出真菌成分。33例有皮肤癣菌感染病甲的菌丝多较细，分隔、分支，可见链状关节孢子，常位于裂隙中，见图3；4例分离出酵母菌病甲的孢子小、散在或群集。1例分离出真菌病甲的菌丝粗而短，着色不均，排列紊乱，多位于裂隙中。9例培养阴性病甲的甲板中均见有真菌成分，菌丝较细，分隔，菌体多侵犯甲板深层，平行、斜行或垂直于甲板表面走行，提示为皮肤癣菌。3例培养阴性的病甲：2例银屑病患者疑合并甲真菌感染标本和1例疑甲真菌感染标本（随访3个月后出现银屑病束状发），见角化不全，大量细胞核残留，无菌丝和孢子，提示为银屑病甲改变，可排除甲真菌病的诊断。
2.4 溶甲法 35例直接镜检阳性标本均检出真菌成分。33例皮肤癣感染的病甲：菌丝多较细，见图4；2例分离酵母菌的病甲，1例见假菌丝和顶端厚壁孢子，提示为白色念珠菌。17例培养阴性的病甲：菌丝多较细，分隔、分支，关节孢子，提示多为皮肤癣菌。
2.5 4种方法检出结果 见表1。
表1 61例疑甲真菌病4种方法检查结果 例(%)
3 讨论
甲真菌病是为数不多的可的甲病之一，因而其正确诊断十分重要。直接镜检检出率较低，本研究为57?38%，但快速、方便，可直接明确有无真菌感染。培养法检出率62.30%，造成培养阳性率低的原因可能是：(1)取材不当，如标本中无活的菌丝存在，取甲屑培养则无菌生长。(2)培养基选择，如放线菌酮在一定程度上抑制皮肤癣菌以外的真菌（酵母菌）生长。培养法要求观察4周，门诊一般也要10天后出报告，耗时虽较长，但可鉴定菌种，进而行药敏试验，对药物的选择有一定指导意义，如克柔念珠菌对氟康唑天然耐药。 病检法检出率75.41%，高于直接镜检和培养法，能观察到真菌在甲中寄生的状况，可对病原菌做初步分类，并可对银屑病等病甲明确诊断，但由于病理切片只能观察甲的断面，相对容易漏诊和误诊，甲切片对切片刀磨损大，制片过程需1周，对实验人员实验组织病要求较高，使该法推广受限。
溶甲法检出率86.89%，高于直接镜检、培养法和病检法。溶甲法通过较高浓度KOH和加热溶解角质，在短时间内将寄生于甲内的真菌充分暴露，洗去甲溶解物质，可使整个病甲而非某一断面的真菌沉淀涂片观察，从而使甲真菌病的检出率大为提高。Liu等于1993年开展了20%KOH处理甲屑后PAS染色诊断甲真菌病［4］，国内甄莉等有类似报道［5］。我们考虑到PAS染色过程需反复冲洗，相对复杂，同时增加了样本损失的可能性，故改用Parker墨水染色。该法能清晰地观察到各种形态的菌丝和孢子，真实地反映了真菌在组织内的寄生形态，从而较全面地辨析病原菌类别；菌丝量多少与甲受累轻重程度相一致，如菌丝少而散在者甲变色变形程度轻，大量菌丝扭曲成团者甲变色变形明显。除典型假菌丝和顶端厚壁孢子提示白色念珠菌感染，曲霉头、帚状枝结构可提示曲霉和青霉感染外，溶甲法不能进行真菌种类的鉴定。
溶甲法在甲真菌病诊断方法中具有准确、快速、简便、价廉及可保存等特点。门诊病例可无需固定步骤，制作湿片即可镜下观察出报告，完成1份标本在1h左右，在日益繁忙的皮肤性病科门诊具有推广价值。
通过对甲真菌病4种诊断方法的对照研究表明：20%KOH溶甲法是一种检出率高、可行性强的甲真菌病诊断方法。结果提示组织病理学检查和20%KOH溶甲法可弥补甲真菌病诊断真菌直接镜检和真菌培养法的不足，显著提高诊断阳性率和准确率。
（本文图片见封三）
【】
1 Roberts DT.Prevalence of dermatophyte onychomycosis in the united Kingdom： results of an omnibus survey. Br J Dermatol， 1992，126(S39)：23-27.
2 Daniel CR.The diagnosis of nail fungal infection. Arch Dermatol，1991，127：1566-1567.
3 牛云彤，李少平.甲真菌病的诊断.麻风皮肤病杂志， 2004，20(1)： 57-58.
4 Liu HN.KOHCPA： a new method for diagnosing tinea unguium. Dermato， 1993，187：166-168.
5 甄莉， 刘亚军.不同浓度NaOH溶解疑甲癣病甲检测真菌41例. 山西医科大学学报， 2000，31(1)：81.
