高同型半胱氨酸血症对球囊损伤大鼠颈动脉核转录因子NF

                                               作者：徐会圃，刘长梅，冯义柏

【关键词】  ,甲硫氨酸

    Effect of homocysteine on expressions of  NFκB and protooncogene in ballooninjured rat carotid arteries

　　【Abstract】 AIM: To study the effect of homocysteine (Hcy) on the expressions of nuclear factorκB (NFκB) P65 protein and cfos, cjun mRNA in common carotid artery of rats after balloon injury and to explore the possible mechanism by which homocysteine exacerbates neointimal hyperplasia after angioplasty. METHODS:  The expressions of NFκB P65 protein and cfos and cjun mRNA were detected by Western blot and semiquantitative RTPCR respectively in the common carotid artery. RESULTS:  The expressions of NFκB P65 protein and cfos and cjun mRNA were significantly higher in  low  methionine (LM) group（1.12±0.13, 1.40±0.21, 1.43±0.25）（P<0.05） and high methionine (HM) group（1.50±0.37, 1.68±0.27, 1.71±0.30）（P<0.01）than those in control group（0.64±0.06, 1.10±0.15, 1.00±0.13）. The expressions of NFκB P65 protein and cfos, cjun mRNA were also significant higher in HM group than those in LM group (P<0.05). CONCLUSION:  Homocysteine may upregulate the transcription of cfos and cjun mRNA in common carotid artery after balloon angioplasty by NFκB pathway, which may be responsible for neointimal hyperplasia induced by homocysteine after angioplasty.

　　【Keywords】 methionine; homocysteine; balloon injury; NFkappaB; protooncogenes

　　【摘要】 目的： 观察高蛋氨酸饮食诱导的高同型半胱氨酸血症对大鼠颈动脉球囊损伤后血管组织NFκBP65蛋白和原癌基因cfos及cjun mRNA表达的影响，探讨同型半胱氨酸在血管球囊损伤后新内膜过度增生中的可能机制. 方法： 采用Western blot及RTPCR方法分别检测血管组织NFκBP65蛋白和cfos及cjun mRNA表达，并做半定量分析. 结果： 低、高蛋氨酸组血管组织NFκBP65蛋白、cfos及cjun mRNA的表达均高于对照组，分别为1.12±0.13 vs 0.64±0.06 （P<0.05）, 1.50±0.37 vs 0.64±0.06 (P<0.01), 1.40±0.21 vs 1.10±0.15 （P<0.05）, 1.43±0.25 vs 1.10±0.15 （P<0.01）及1.68±0.27 vs 1.00±0.13 （P<0.05）, 1.71±0.30 vs 1.00±0.13 （P<0.01）,高蛋氨酸组也明显高于低蛋氨酸组(P<0.05). 结论： 同型半胱氨酸有可能通过NFκB通路上调血管内皮损伤后动脉组织原癌基因cfos及cjun mRNA的表达，这可能是其促进血管内皮球囊损伤后新内膜过度增生的机制之一.

　　【关键词】 甲硫氨酸；同型半胱氨酸；球囊损伤；原癌基因；NFκB
 
　　0引言

　　实验研究和临床观察表明，血中同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)升高可引起动脉粥样硬化和血栓形成［1-2］. 然而其在血管内皮球囊损伤后新内膜增生中的作用及其机制尚不清楚. 我们用高蛋氨酸（methionine）饮食诱导高同型半胱氨酸血症，观察其对血管内皮球囊损伤后血管组织NFκB P65蛋白及原癌基因表达的影响，以探讨Hcy促进血管内皮球囊损伤后新内膜过度增生的可能机制.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　健康雄性12 wk SD大鼠30只(华中科技大学同济医学院动物中心提供)，体质量280~320 g，随机分为对照组（C）(给普通饲料)，低蛋氨酸组(LM)(含蛋氨酸12 g/kg饮食),高蛋氨酸组(HM)（含蛋氨酸20 g/kg饮食），每组10只，各组均自由进食. 蛋氨酸(北京中山生物技术有限公司，化学纯，批号： 1903001)，总RNA提取试剂(Trizol)及逆转录试剂盒为Giblo公司产品，TaqDNA聚合酶cfos, cjun及内参βactin上、下游引物为TaKaRa大连宝生物工程有限公司产品；兔抗大鼠NFκB P65多克隆抗体、Western blot检测试剂盒均购自武汉博士德公司. 自制2F球囊导管购自天津乳胶制品厂；PCR扩增仪(美国MJPC150公司)，图像分析仪为上海四星公司产品. 高效液相色谱仪(美国water公司).
 
　　1.2方法

　　1.2.1动物模型建立及标本采集动物喂养4 wk后，体质量(350~400) g,禁食12 h，用30 g/L戊巴比妥钠注射麻醉(30 mg/kg, ip). 沿颈前正中线切开皮肤，在颈前三角区暴露左右颈内、外及颈总动脉，结扎左颈外动脉的远心端，用微动脉夹夹住左颈总动脉的近心端及左颈内动脉，切开左颈外动脉的近心端，然后将自制2F球囊导管自颈外动脉的近心端插入颈总动脉至起始部，球囊注入生理盐水，使其充分扩张致有轻度阻力感，然后回拉球囊使球囊达颈动脉分叉处，重复3次，完成后负压回抽球囊中的生理盐水，取出球囊导管，结扎左颈外动脉. 以右侧颈总动脉作为正常对照，只分离血管但不做球囊损伤. 术后1 h，每只动物心脏采血2 mL,立即3000 r/min离心15 min，-20℃冻存待测. 然后脊椎脱臼法处死动物，并立即取左右颈总动脉液氮冻存备用.
 
　　1.2.2血浆同型半胱氨酸及蛋氨酸测定每只动物采血2 mL,置于20 g/L EDTANa2的试管中，混匀，30 min内，标本于4℃用3000 r/min离心15 min，分离出的血浆移入相应的EP管，-20℃冻存，留做血浆Hcy和蛋氨酸检测，血浆Hcy检测按［3］的方法稍作改良，采用高效液相色谱仪测定血浆Hcy水平，所用试剂批内变异系数<5%,批间变异系数<10%. 血浆蛋氨酸测定应用日立83550全自动氨基酸分析仪，采用阳离子交换树脂、分离和茚三酮显色等方法测定.

 
　　1.2.3Western blot法检测血管组织NFκBP65蛋白的表达参照博士德公司提供的蛋白提取方法,用缓冲液裂解颈总动脉组织得到组织总蛋白. 以牛血清蛋白作为标准品,根据蛋白定量试剂盒的说明绘制蛋白定量标准曲线,于紫外分光光度计750 nm下测光密度Ａ值,蛋白提取液的浓度. 将优化表达的NFκB P65蛋白用100 g/L聚丙烯凝胶电泳分离后电转移至硝酸纤维素膜上,封闭后,先加兔抗鼠NFκB（P65）多克隆抗体（1∶500）,再加辣根过氧化物酶结合的驴抗兔多克隆抗体(1∶500),用化学发光法显影，用图像分析系统测定吸光光度值，NFκB P65蛋白的表达量以光密度的相对比值表示.
 
　　1.2.4cfos, cjun mRNA表达的检测① 引物序列如下： cfos上游： 5′TCCCAGAGGAGATGTCTGTG3′,下游： 5′GGCTCCAGCTCTGTGACCAT3′，扩增片段331 bp. Cjun上游： 5′GCCTGCACAGTGAGCCTCCG3′下游： 5′AGTTGGCACCCACTGTTAAC3′ 扩增片段490 bp. βactin上游： 5′CCTAAGGCCAACCGTAAAG3′下游: 5′TCTTCATGGTGCTAGGAGCCA3′,扩增片段623 bp. ② 总RNA抽提和cDNA第一链的合成： 用Trizol试剂抽提左右颈总动脉组织总RNA，各RNA样本A260 nm/A280 nm的比值均在1.8~2.0之间，用逆转录试剂盒合成cDNA第一链. ③ PCR反应条件： 目标基因反应条件如下，94℃预变性2 min，进入PCR循环： 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 40 s,共35个循环，结束前72℃延伸7 min;内参反应条件： 94℃预变性2 min, 94℃ 20 s, 62℃ 30 s, 72℃ 30 s;共28个循环，结束前72℃延伸7 min. ④ PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳，EB染色，用生物凝胶电泳图象分析系统对电泳条带进行灰度积分，并以βactin校正.
 
　　统计学处理： 所有数据以x±s表示，组间比较采用方差分析和SNKq检验，统计处理用SPSS统计软件，P<0.05为有统计学意义.

　　2结果

　　蛋氨酸组血浆蛋氨酸和同型半胱氨酸浓度均显著高于对照组(P<0.01),低、高两组之间也有明显差异（P<0.05，表1）. 低及高蛋氨酸组NFκB P65蛋白表达与对照组比较有显著差异（P<0.05, P<0.01）,低高两组之间差异也有显著性（P<0.05，表2)；右颈总动脉组织有微弱表达（0.13±0.03). 低蛋氨酸组及高蛋氨酸组cfos及cjun mRNA的表达与对照组比有明显差异(P<0.05, P<0.01),低蛋氨酸组与高蛋氨酸组相比也有显著差异(P<0.05) （表1，图1A, B, C)； 右颈总动脉组织cfos 及cjun mRNA仅有微弱表达，分别为0.58±0.07和0.49±0.06(图1A, B, C).表1各组喂养4 wk后血浆蛋氨酸和Hcy水平比较(略)  表2各组血管组织NFκB P65蛋白和cfos, cjun mRNA表达的比较（略）

　　3讨论

　　我们的实验结果表明短期给予高蛋氨酸饮食，不仅可以引起高蛋氨酸血症，而且可引起高Hcy血症. Hcy在动脉粥样硬化中的作用已得到大量资料的认可；最近研究发现高Hcy血症加重了球囊损伤大鼠颈动脉新内膜的增生［4］，但其在血管内皮球囊损伤后新内膜过度增生中的具体机制，目前尚不清楚.

　　研究表明，血管内皮球囊损伤后的早期，血管壁组织原癌基因cfos及cjun的表达即明显上调［5］，在1 h左右达高峰. 我们的实验结果表明在血管内皮球囊损伤后1 h处死动物，在对照、低蛋氨酸及高蛋氨酸组cfos, cjun mRNA的表达均明显高于右侧颈总动脉，右侧颈总动脉仅有微弱表达，且发现其表达与Hcy呈浓度依赖关系， 说明Hcy对cfos及cjun的表达有激发作用. 原癌基因cfos及cjun的表达产物活化后可形成活性蛋白－1(Activation protein1, AP1),是细胞核内重要的转录因子，可激活细胞核DNA转录和核蛋白的合成，参与调控细胞增殖分化和转化等重要生物学行为［6］，使血管平滑肌细胞可进入增殖周期并发生功能变化，由收缩型转变成活成型. 此外，原癌基因cfos及cjun的转录产物还可介导多种细胞因子，尤其是生长因子的表达. 这就启动了损伤血管局部平滑肌细胞活化的自分泌、旁分泌机制，损伤动脉局部将有持续的血管平滑肌细胞过度增殖和分化，从而有利于血管内皮球囊损伤后新内膜的过度增生而造成再狭窄.

　　本实验涉及的NFκB P65是NFκB家族/Rel家族的重要组成成员之一，目前研究显示，在细胞中最常见的形式为P65及P50组成的NF－κB异二聚体，正常情况下与其抑制物IκBα结合，存在于正常细胞的的胞质内，多种刺激信号，如细胞因子、氧自由基、细菌和病毒产物等可以引起IκBα的磷酸化和降解，NFκB脱离NFκB: IκBα复合体，迅速移位于核内，与特定的基因启动子区的κB结合位点结合，诱导基因的表达［7］，如细胞因子、原癌基因、黏附分子等. 我们的实验比较了NFκB P65蛋白在低高蛋氨酸组和对照组大鼠颈动脉球囊损伤后血管组织中的表达，结果发现低、高蛋氨酸两组的表达与对照组有明显差异（P<0.05, P<0.01）,且低高蛋氨酸组两组之间也有显著差异（P<0.05）. 提示NFκB可能参与了Hcy介导的平滑肌细胞cfos, cjun mRNA的表达，这也许是Hcy加重血管内皮球囊损伤后新内膜增生的重要机制之一.
 
　　Wang等［8］近期研究发现，Hcy可刺激血管平滑肌细胞NFκB的激活，从而使平滑肌细胞表达和释放单核细胞趋化因子，也支持我们的研究. 但关于Hcy诱导NFκB活化进而诱导原癌基因表达的胞内信号机制十分复杂，有待于今后进一步阐明.

　　【文献】

　　［1］ Haynes WG. Hyperhomocysteinemia, vascular function and atherosclerosis: Effects of vitamins ［J］. Cardiovasc Drugs Ther, 2002,16(5)391-399.

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　　［4］ 徐会圃，冯义柏. 高同型半胱氨酸血症对大鼠颈动脉损伤后新内膜增生的影响［J］. 康复医学杂志，2004,19（2）:115-117.

　　［5］ Miano JM, Vlasic N, Tota RR, et al. Smooth muscle cell immediateearly gene and growth factor activation follows vascular injury ［J］. Arterioscler Thromb, 1993,13(2):211-219.

　　［6］ Karin M. The regulation of AP1 activity by mitogen activated protein kinases ［J］. J Biol Chem, 1995,270(28):16483-16486.

　　［7］ Zhu J, Mix E, Olsson T, et al. Cellular mRNA expression of interferongamma,IL4 and transforming growth factorbeta (TGFβ) by rat mononuclear cells stimulated    with peripheral nerve myelin antigens in experimental allergic neuritis ［J］. Clin Exp Immunol,1994,98(2):306-312.

　　［8］ Wang G, Siow YL. Homocysteine stimulates nuclear factor kappaB activity and monocyte chemoattractant protein1 expression in vascular smoothmuscle cells: A possible role for protein kinase C ［J］. Biochem J, 2000,352(Pt3):817-826.