甲醛吸入对小鼠免疫系统毒性作用
【摘要】 目的 通过吸入甲醛(formaldehyde，FA)染毒小鼠观察其免疫损伤作用。方法 选用健康清洁级昆明种小鼠30只，随机分成5组(即阴性对照组1，3，5?mg/m3染毒组和阳性对照组)，每组6只，用静式吸入染毒方式染毒14?d处死后，脾脏系数、胸腺系数；测定脾脏和胸腺CD3含量、CD4含量、CD8含量；测定巨噬细胞吞噬功能、迟发超敏反应、抗体生成细胞数及脾脏淋巴细胞功能转化。结果 甲醛吸入染毒可以引起小鼠脾脏系数、胸腺系数减小(P<0?05或P<0?01)；脾脏和胸腺CD3、CD4、CD8含量降低，CD4/CD8明显增大(P<0.05或P<0.01);脾淋巴细胞转化功能、迟发变态反应强度、抗体生成细胞数、巨噬细胞吞噬功能均随染毒剂量的升高而下降(P<0.05或P<0.01)。结论 吸入甲醛可导致小鼠免疫系统的全面损伤
【关键词】 甲醛；免疫损伤；免疫功能
近年来，随着社会和人民生活水平的不断提高，室内空气污染已成为一个公众所关注、迫切需要解决的卫生问题〔1〕。甲醛(Formaldehyde,FA)是造成室内空气污染的主要物质〔2〕，其对人体的健康危害不容忽视。目前，对甲醛造成的免疫损伤国内外研究较少。因此，本文从免疫病理、细胞免疫、体液免疫及非特异性免疫等4个方面对甲醛的免疫毒性作用进行了研究，为建立甲醛免疫毒性的卫生标准提供理论依据。
1 材料与方法
1?1 主要试剂
甲醛，分析纯(上海溶剂厂)；注射用环磷酰胺(CP)(上海华联制药有限公司)；淋巴细胞分离液，Q/GHSB 85-2001(上海恒信化学试剂有限公司)；3-氨丙基三乙氧硅烷(APES)，32K1265(武汉博士德生物工程有限公司);兔抗鼠CD3、CD4、CD8单克隆抗体，即用型RSC7219K(天津灏洋生物工程有限责任公司);浓缩型二氨基联苯胺显色(DAB)试剂盒(天津灏洋生物工程有限责任公司);刀豆蛋白A(ConA)、四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)试剂盒(北京夏斯生物技术有限公司)。
1?2 仪器及设备
50?L静式染毒柜；GS-3交直流两用大气采样仪；VIS-7220分光光度计：PRECISA 300MC天平；SHZ-22水浴恒温振荡器；光学显微镜，BH-2(日本OLYMPUS公司)；QL-901旋涡混合器等。
1?3 实验方法
采用健康昆明种纯系小鼠30只，鼠龄7周，体重18～22?g(山西医科大学动物中心)。将动物随机分为5组(即阴性对照组，1，3，5?mg/m3染毒组和阳性对照组)，每组6只，雌雄各半。采用甲醛静式吸入染毒，每天染毒2?h，连续染毒14?d。阴性对照组吸入过滤的新鲜空气，处理时间与染毒组相同。阳性对照组从第8?d开始，每日按40?mg/(kg·bw)(用生理盐水配制)腹腔注射环磷酰胺(CP)，连续7?d。染毒结束次日称重小鼠后，颈椎脱臼处死，无菌取脾脏、胸腺，除去血液，滤纸吸干，称重。
1?4 免疫指标测定
(1)计算脾脏(胸腺)系数：脾脏(胸腺)系数=器官重量(mg)/体重(g)；(2)脾脏和胸腺CD3含量、CD4含量、CD8含量测定：将取出的小鼠脾脏、胸腺按〔3〕方法制备成浓度为1×106的细胞悬液，再取其50?μl滴于经APES处理过的载玻片上，制成淋巴细胞涂片，之后分别按试剂盒说明书对脾脏、胸腺CD3、CD4、CD8含量进行测定，计算阳性细胞率；(3)脾脏淋巴细胞功能转化测定：采用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法〔4〕； (4)迟发型超敏反应测定：采用足垫增厚法〔5〕；(5)抗体生成细胞数测定：采用溶血空斑试验(PFC试验)〔6〕；(6)巨噬细胞吞噬功功能测定：采用鸡红细胞吞噬实验〔7〕。
1?5 统计分析
采用SPSS?10?0统计软件进行方差齐性检验、方差分析、相关分析。
2 结果
2?1 小鼠脾脏、胸腺系数测定(表1) 表1 甲醛对小鼠脾脏、胸腺系数的影响(略)注：与阴性对照组比较，* P<0?05，** P<0?01
从表1可知，各甲醛染毒剂量组小鼠脾脏、胸腺系数随染毒剂量升高呈明显下降趋势，除1?mg/m3染毒组脾脏系数与对照组比较差异无统计学意义外，其他各染毒剂量组与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0?05或P<0?01)。
2?2 甲醛对小鼠脾脏、胸腺CD3、CD4、CD8含量的影响(表2、表3) 表2 甲醛对小鼠脾脏CD3、CD4、CD8的影响(略)注：与阴性对照组比较，* P<0?05，** P<0?01 表3 甲醛对小鼠胸腺CD3、CD4、CD8的影响(略)注：与阴性对照组比较，* P<0?05，** P<0?01
从表2可知，各甲醛染毒剂量组小鼠脾脏CD3、CD4、CD8阳性细胞数随甲醛染毒剂量的升高呈明显下降趋势，除1mg/m3染毒组CD3含量、CD4含量及3mg/m3染毒组CD4含量外，其他各测量值与对照组比较差异有统计学意义(P<0?01)，并且两者间呈剂量反应关系(r=0?771，P<0?01；r=0?660，P<0?01；r=0?914，P<0?01)；且CD4/CD8明显增大，与对照组比较差异有统计学意义(P<0?05)。
从表3可知，各染毒剂量组小鼠胸腺CD3、CD4、CD8阳性细胞数明显低于对照组，除1?mg/m3染毒组外，其他组与对照组比较差异有统计学意义(P<0?05或P<0,01)，小鼠胸腺CD3、CD4、CD8阳性细胞数与甲醛染毒剂量间有明显剂量-反应关系(r=0?881，P 2?3 脾淋巴细胞功能转化实验 1，3，5?mg/m3甲醛染毒组小鼠脾淋巴细胞转化功能吸光度(A)值分别是(0?267±0?124),(0?235±0?058),(0?227±0?158),与对照组小鼠脾淋巴细胞转化功能吸光度(A)值(0.467±0?089)比较，差异有统计学意义(P<0?05或P<0.01)。 2?4 迟发型超敏反应测定 随甲醛染毒剂量的升高，各染毒剂量组小鼠迟发超敏反应强度呈明显下降趋势，3个染毒组小鼠足垫厚度差分别为(0?059±0?025),(0?048±0?021),(0?036±0?018)mm，与对照组小鼠足垫厚度差(0?075±0?021)mm比较，差异有统计学意义(P<0?05)。 2?5 抗体生成细胞测定 随染毒剂量的增加，小鼠抗体生成细胞数依次为(0?855±0?106),(0?445±0?081),(0?323±0?056)个，与对照组(1?018±0?245)个比较，差异有统计学意义(P<0?05或P<0?01)。 2?6 巨噬细胞吞噬功能测定 从表4可知，各剂量甲醛染毒组小鼠巨噬细胞吞噬功能随甲醛染毒剂量的升高呈明显下降趋势，除1?mg/m3染毒组与对照组比较差异无统计学意义外，其他各组与对照组比较差异均有统计学意义(P<0?05或P<0?01)，并存在剂量-反应关系(r=0?93,P<0?01；r=0?952，P<0?01)。表4 甲醛对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响(略)注：与阴性对照组比较，** P<0?01 3 讨论 研究认为，现在室内空气污染已经取代过去的煤烟型污染和光化学烟雾型污染，而成为危害人们健康的主要污染源〔8〕。居民室内装修后空气中甲醛严重超标。有研究认为，吸入甲醛可导致机体免疫系统自稳功能破坏，引起免疫功能损害，继而出现一系列相关症状〔9〕。本次研究发现，甲醛在低剂量和高剂量时均可引起小鼠脾脏、胸腺重量下降，导致小鼠脾脏、胸腺CD3、CD4、CD8阳性细胞数减少，CD4/CD8比值增大；也能抑制脾淋巴细胞功能转化、迟发型超敏反应、抗体生成细胞数及巨噬细胞吞噬功能。脾脏、胸腺系数降低，表明甲醛可引起机体的免疫病理损伤；T细胞亚群阳性细胞数减少，以及脾淋巴细胞功能转化、迟发型超敏反应减弱，提示机体的细胞免疫也受到了明显的抑制；同时，抗体形成细胞数减少、巨噬细胞吞噬功能减弱证明甲醛对体液免疫和非特异性免疫均有不同程度的损伤。因此，认为甲醛可对机体的免疫系统造成全面的损伤，其作用机制有待进一步研究 【】
〔1〕戴天有,刘德全，曾燕君，等.装修房屋室内空气污染［J］.环境研究，2002，15(4)：24-29.
〔2〕王南南，叶琳.甲醛暴露的生物标志物研究现状［J］.公共卫生，2004，22(8)：1004-1006.
〔3〕朱立平，陈学清.免疫学常用实验方法［M］.北京：人民军医出版社，2000：384.
〔4〕薛彬，雷志明.用一种改良的MTT颜色反应法测定淋巴细胞转化［J］.卫生毒杂志，1988，2(1)：61-63.
〔5〕刘国谦.细胞毒理学［M］.北京：军事医学科学出版社，2001：2.
〔6〕文育峰，姚应水，王金泉，等.甲醛对小鼠免疫系统的影响［J］.皖南医学院学报，2001，20(3)：167-168.
〔7〕王成祥，王惠芳，姜良铎，等.清肺饮对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响［J］.中国中医药信息杂志，2003，10(10)：32-33.
〔8〕陈学敏.环境卫生学［M］.4版.北京：人民卫生出版社,2001：22.
〔9〕Baba K，Yagi T，Niwa S,et al.Measurement of formaldehyde-specific IgE antibodies in adult asthmatics［J］.Areri,2000,49:404.
