N?乙酰半胱氨酸对镉致人胚肾细胞凋亡拮抗作用
【摘要】 目的 探讨N?乙酰半胱氨酸(N?acetyl cysteine,NAC)对氯化镉所致人胚肾(human embryonic kidney,HEK)细胞凋亡的拮抗作用。方法 应用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)比色法和流式细胞术(flowcytometry,FCM)检测不同CdCl2浓度(0，10，20，40，80μmol/L)处理以及不同浓度NAC(1，2，4，8mmol/L)和镉联合作用对HEK细胞相对存活率和凋亡率的影响。结果 单纯染镉时，与对照组(0μmol/L)比较，20，40，80μmol/L CdCl23组HEK细胞相对存活率明显降低(P<0.01)，HEK细胞凋亡率明显升高(P<0.01)；NAC与镉联合作用时，与40μmol/L CdCl2比较，40μmol/L CdCl2+4，8mmol/L NAC2组HEK细胞相对存活率明显提高，40μmol/L CdCl2+2，4，8mmol/L NAC3组HEK细胞凋亡率明显降低。结论 一定浓度氯化镉可引起HEK细胞凋亡增加，NAC可以拮氯化镉引起的细胞凋亡。
【关键词】 镉
镉(Cadmium,Cd)在环境中不能降解，最终通过食物链转移到人体，其生物半减期长达10～30年，故在机体中长期蓄积而造成毒作用〔1〕。镉中毒所致机体损伤机制十分复杂且尚不明确。镉可通过细胞内钙超载、基因表达异常与氧化应激等多种途径引起细胞凋亡。其致细胞凋亡的机制与过程不完全相同，有研究显示〔2，3〕，镉致肝、肾细胞损伤与细胞凋亡关系密切。N?乙酰半胱氨酸(NAC)作为一种巯基供给体，主要是一种抗氧化剂，具有抗细胞凋亡作用。本实验研究不同浓度的镉对人胚肾细胞存活力、凋亡率的影响以及NAC对染镉人胚肾细胞凋亡的影响，为镉中毒的发病机制和防治研究提供依据。
1 材料与方法
1?1 主要化学试剂 氯化镉(CdCl2 2.5H2O)，优级纯；DMEM培养液；四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)；碘化丙啶(PI)；胎牛血清；胰蛋白酶。
1?2 主要仪器 BB15型CO2恒温培养箱(德国Heraeus公司)；BD?FACScan流式细胞仪，SUNRISE酶标仪(瑞典Tecar公司)。
1?3 人胚肾(HEK)细胞的培养 将HKE细胞接种于培养瓶中，用胎牛血清(DMEM)培养液进行培养，每天换液1次。培养条件：95%O2，5%CO2，37℃。
1?4 HEK细胞活力的测定 参照四甲基偶氮噻唑蓝比色法(MTT)〔4〕进行。将长成平层的HEK细胞用0.2%胰酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞密度为2×105个/ml，接种于96孔板培养24h，待细胞贴壁后分别以不同浓度的CdCl2(0，10，20，40，80μmol/L)处理和40μmol/L CdCl2+1，2，4，8mmol/L NAC处理，每个剂量设6个复孔，37℃孵育3h后，每孔加入15μl MTT(5mg/ml)继续培养4h后吸弃全部培养液，每孔加入150μl二甲基亚矾(DMSO)终止反应，振摇10min，在酶标仪570nm吸收光波长处检测A值，分析各组细胞生长的情况。细胞相对存活率(%)=(实验组A/对照组A)×100%
1?5 流式细胞仪检测细胞凋亡 参照流式细胞术(FCM)〔5〕方法进行。将长成平层的HEK细胞用0.2%胰酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×106个/ml，接种于细胞培养瓶培养24h，待细胞贴壁后，吸去原培养液，分别以不同浓度的CdCl2(0，10，20，40，80μmol/L)处理和40μmol/L CdCl2联合1，2，4，8mmol/L NAC处理，每个剂量设6个复孔，37℃孵育3h后，每孔加入PI染液，充分振摇，避光静置30min，用BD?FACScan型流式细胞仪进行检测。检测条件在为2W氩离子激光器，输出功率为300nm，激发波长为488nm，发射波长为605nm,测量数据输入HP?300Constor30机，应用相应的软件进行资料处理。
1?6 统计分析 采用Excel建立数据库，用SPSS10.0软件进行单因素方差分析及组间差异的显著性检验，两两比较用q检验。
2 结果
2?1 不同浓度Cd对HEK细胞相对存活率影响(图1) 由图1可见，与对照组(0μmol/L)比较，10μmol/L CdCl2使HEK细胞相对存活率有所降低，但差异无统计学意义，20，40，80μmol/L CdCl2组HEK细胞相对存活率明显降低(P<0.01)。
图1 Cd对HEK细胞相对存活率影响（略）
2?2 NAC与Cd联合作用对HEK细胞相对存活率影响(表1) 由表1可见，单纯染镉组和各浓度(1，2，4，8mmol/L)NAC与镉联合组HEK细胞相对存活率均显著低于阴性对照组(0.9%NaCl)(P<0.01)；与阳性对照组(40μmol/L CdCl2)比较 ，40μmol/L CdCl2+1，2mmol/L NAC组HEK细胞相对存活率有所升高，但差异无统计学意义；40μmol/L CdCl2+4，8mmol/L NAC组HEK细胞相对存活率显著升高(P<0.01)；40μmol/L CdCl2+8mmol/L NAC组HEK细胞相对存活率高于40μmol/L CdCl2+4mmol/L NAC组，但差异无统计学意义。
表1 NAC与Cd联合作用对HEK细胞相对存活率影响（略）
注：与阴性对照组比较，a P<0.01；与阳性对照组比较，b P<0.01
2?3 不同浓度Cd对HEK细胞凋亡率的影响 与对照组(0μmol/L)比较，10μmol/L CdCl2使HEK细胞凋亡率有所升高，但差异无统计学意义，20，40，80μmol/L CdCl2组HEK细胞凋亡率显著升高(P<0.01)；10，20，40μmol/L CdCl2组HEK细胞凋亡率逐渐升高，而80μmol/L CdCl2组HEK细胞凋亡率与40μmol/L CdCl2组比较有所降低(P<0.05)。
2?4 NAC与Cd联合作用对HEK细胞凋亡百分率的影响 与阴性对照组比较，各组HEK细胞凋亡率均显著升高(P<0.01)，与阳性对照组(40μmol/L CdCl2)比较，40μmol/L CdCl2+NAC1组HEK细胞凋亡率有所降低，但差异无统计学意义，40μmol/L CdCl2+NAC2，4，8组HEK细胞凋亡率显著降低(P<0.01)，随着NAC剂量增大，HEK细胞凋亡率也逐渐降低。
3 讨论
镉的毒性与氧化损伤密切相关，镉中毒时，镉引起的氧化损伤与细胞内的谷胱甘肽耗竭有关〔6〕。氧化应激是镉诱导凋亡的机制之一。本实验研究表明，20μmol/L CdCl2可使HEK细胞相对存活率明显下降，凋亡率明显升高，且随着染Cd剂量的增加，凋亡率随之升高，当浓度达80μmol/L时，可能是由于较高浓度Cd使HEK细胞死亡增多，凋亡率有所下降。NAC是一种小分子量的氧自由基清除剂，易进入细胞，脱乙酰基后成为合成谷胱甘肽的前体，促进谷胱甘肽的合成，提高细胞内谷胱甘肽的含量，增强细胞抗自由基损伤的能力〔7〕。有研究表明〔8〕，NAC可阻断细胞凋亡过程，并可作为自由基的清除剂，干扰自由基的形成，清除参入凋亡信号转导的活性氧中间体，NAC还可以干扰凋亡出现后下游的信号。本研究发现，4mmol/L NAC显著提高染镉HEK细胞存活率，2mmol/L NAC使HEK细胞凋亡率明显降低，提示一定浓度NAC具有拮抗镉诱导细胞凋亡的作用。本研究结果显示，NAC能在一定范围内提高HEK细胞凋亡率，但不能恢复至阴性对照水平，可能是由于NAC主要通过抗氧化拮抗镉的毒性，提示氧化损伤致细胞凋亡是镉致细胞凋亡的原因之一。
【】
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