人用H5N1禽流感疫苗检定评价
作者：朱智勇，丁晓航，朱函坪，李岩金，陈学奎，沈吉友，张涛，何培江，姚苹苹，徐芳，翁景清，龚华岳，郭志宏，苏波，孙淑滨，粱伟峰
【关键词】 禽流感疫苗；生产工艺；疫苗检定；疫苗质量
摘要： 目的 选用H5N1禽流感毒种(R1194和R1203)，按设计的生产工艺，制成的疫苗进行全面检定，选取其中较好毒株生产的疫苗，用于以后人用禽流感疫苗临床前研究的动物免疫。方法 利用从国外引进2株H5N1禽流感病毒，设计生产3种疫苗（全病毒、裂解-1、裂解-2）的纯化工艺， 优化纯化条件，全面检定制成的疫苗，比较2毒种生产疫苗的质量。结果 2毒株在接种滴度104EID50/ml（半数鸡胚感染剂量/ml），培养温度345℃，培养时间3d的条件下，病毒增殖滴度较高；检定结果证明，制成的所有疫苗中反映质量的内毒素、卵清蛋白、总蛋白、总蛋白与血凝素之比这4项指标，明显优于国家标准；3种工艺疫苗的电镜形态完全不同；经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，全病毒疫苗和裂解-2疫苗的蛋白条带形态相似，但裂解-1疫苗在32KD左右的条带缺失；毒种R1203株疫苗的产量明显高于R1194株。结论 设计的3种生产疫苗的纯化工艺，均可生产出高质量的疫苗；毒种R1203株的疫苗产量高于毒种R1194株；可用 R1203毒株，按3种不同工艺生产的疫苗接种动物，观察免疫效果。
关键词： 禽流感疫苗；生产工艺；疫苗检定；疫苗质量
Study on avian influenza(H5N1) vaccine used in human
Abstract： Objective The vaccines were produced by the designed techniques with the seeds (R1194 and R1203) of avian influenza viruses and checked entirely.A better one from the two seeds was selected to immunize animals for the next research.Methods The three purified techniques of the vaccines (the whole viruses、split-1 and split-2) were designed and the vaccines were produced with the two imported virus seeds.The purified condition of the vaccines was perfected.A better one from the two seeds was chosen to immunize animals.Results The multiplication titers in the two viruses were higher at the inoculation titer of 104EID50/ml(02ml/egg) incubation temperature of 345℃ and incubation time of three days.The four items of endotoxin、egg-albumin、total albumin and total albumin /hemoglobin，which reflected the vaccine quality in the all produced vaccines，were better than the national standards.The form of the vaccines produced by the three techniques was totally different with electron microscopy.The albumen zone form with SDS-PAGE electrophoresis were similar in the whole virus vaccines and split-2 vaccine while the albumen zone of the split-1 vaccine could not be seen in 32KD rightandleft.The vaccine output with the seed R1203 was much more than that with the seed R1194.Conclusion The high quality vaccines can be produced by the three production techniques for purified vaccines.The vaccine output with R1203 is more than that with R1194.The vaccines produced by the three different techniques with the R1203 virus seeds can be used to immunize animals and to observe their antibody response.
Key words： avian influenza vaccine；production technique；vaccine assay;vaccine quality
在人用H5N1禽流感疫苗研究的第一部分中证实，从国外引进的R1194和R1203两株毒种为减毒株，符合目前国际用于制造人用H5N1亚型禽流感疫苗的标准。并按照我国对研制疫苗的要求，设计3种生产疫苗的纯化工艺，制造疫苗，对制成的疫苗进行全面检定，选取其中较好株毒种生产的疫苗，用于人用禽流感疫苗临床前动物免疫的研究。
1 材料与方法
11 材料 (1)毒种：H5N1禽流感毒种R1194株和R1203株(英国国家生物制品检定所和美国疾病控制中心)；(2) 生产疫苗胚蛋：来源于封闭式房舍内饲养的健康鸡群；(3)滤器和滤膜(美国Millipore公司)；(4)β-丙内脂(美国Sigma公司)，用于灭活病毒；(5)Triton N101(美国Aldrich公司)，用于裂解病毒；(6)脱氧胆酸钠(上海伯奥生物科技公司进口分装)，用于裂解病毒；(7)凝胶柱(瑞典安发玛西亚生物技术公司)，型号：PBG 300/950；(8)凝胶Sephrose-4FF(瑞典安发玛西亚生物技术公司)；(9)超声波细胞粉碎机(宁波新芝公司)；(10)区带离心机(日本日立公司)；(11)电泳仪(美国伯乐公司)。
12 方法 (1)总蛋白测定：采用Lowry法；(2)卵清蛋白测定：采用对流免疫电泳法；(3)细菌内毒素测定：鲎试验定量法；(4)病毒液浓缩：先用15000r/min连续离心澄清，再超滤膜浓缩40～50倍；(5)病毒灭活验证试验：标本接种胚蛋，培养后，再盲传一代，血凝应阴性；(6)蔗糖梯度密度离心：待纯化的病毒液30000r/min梯度离心3h，收集病毒峰，用磷酸盐缓冲液(PBS)进行超滤清洗，去除蔗糖；(7)显微镜观察：由浙江医学院电镜室协助拍摄。
2 结果
21 生产工艺的设计 普通流感疫苗已有６0年的生产，工艺比较成熟，根据生产流感疫苗的经验，设计了3种禽流感疫苗的生产工艺：(1)全病毒疫苗：毒种接种鸡胚经培养、收液、超滤浓缩、β-丙内脂灭活、层析、区带离心等纯化程序，病毒未经裂解处理。(2)裂解-1疫苗：程序相似，中间增加用裂解剂Triton N101和脱氧胆酸钠，裂解病毒的处理。(3) 裂解-2疫苗：仅用裂解剂Triton N101裂解病毒的处理。
22 主要技术参数(表1) 比较2毒种的不同滴度接种蛋胚，经不同温度和不同时间培养结果表明，接种剂量为104EID50/ml (02ml)，培养温度345℃，培养时间3d较好。
表1 不同滴度和不同温度及时间接种培养效果比较（略）
注：(104)，(103)为接种滴度
23 病毒灭活 采用1∶4000β-丙内脂，4℃， 作用24h，经病毒灭活验证试验证明，对R1194或R1203毒株均可灭活。
24 病毒裂解 经采用Triton N101和脱氧胆酸钠，在超声波的作用下，对R1194或R1203毒株均可裂解。
25 电镜观察(图1) 从图1可见，3种工艺生产的疫苗形态完全不同，全病毒疫苗的病毒形态比较完整，裂解-1疫苗对病毒的裂解比较细，已看不见完整的病毒及碎片，裂解-2疫苗均为不完整的病毒及病毒碎片。
图1 3种工艺生产的禽流感疫苗的电镜结果（略）
26 疫苗的SDS-PAGE的电泳结果(图2) 从图2可见，全病毒疫苗和裂解-2疫苗的形态相似，而裂解-1疫苗，在32KD左右的条带已缺失。
M:mark；1:全病毒苗；2:裂解-1疫苗；3～5:裂解-2疫苗
图2 3种生产工艺疫苗的SDS-PAGE电泳结果（略）
27 疫苗的核酸扩增(图3) 用国家流感中心提供确诊 H5N1 禽流感病毒的引物，扩增３种疫苗的电泳。
M:mark；1:裂解-1疫苗；2:裂解-2疫苗；3:全病毒苗
图3 H5N1禽流感病毒引物扩增3种疫苗的电泳结果（略）
从图3可见，3种疫苗在378bp处均有明显的条带，证明裂解后的疫苗还能扩增到禽流感病毒的基因片段。
28 浓缩和纯化 通过对血凝素含量的测定，了解浓缩和纯化每一环节对抗原活性成分的影响，确立最佳方法和条件，达到优化的目的，并制订相应的参数，建立稳定的浓缩纯化工艺。
29 原液的检定及产出比(表2) 对浓缩和纯化后的疫苗原液进行全面检定，并出投入鸡蛋数与疫苗产出比。从表2可知，制备的3种疫苗原液，主要指标均明显优于国家标准，投入的鸡胚量与疫苗产出比(按每人15mg2针30μg计算)R1194毒种制的疫苗每人份需163个蛋，而R1203毒种制的疫苗仅需107～122个蛋。因而下一步的研究，用R1203株制成的疫苗进行动物接种，以比较3种不同工艺生产疫苗的免疫效果。
表2 疫苗原液检定结果及产出比（略）
3 讨论
自1937年流感病毒在鸡胚中获得培养成功，使鸡胚可用于大量生产流感疫苗，直至今日，世界各国提供的流感疫苗，绝大部分是用鸡胚生产的灭活疫苗。本研究获得的R1194和R1203禽流感毒株，也为鸡胚适应株，故采用鸡胚培养病毒。由于无致病菌(SPF)鸡蛋缺少且价格昂贵，无法满足疫苗生产的巨量需求，因而目前我国规定，制备疫苗毒种必须用SPF鸡蛋，而生产疫苗可用封闭饲养健康鸡群的蛋，由于本研究的工艺设计中有甲醛防腐(也能杀死99999%病毒，即从108/ml降至103/ml左右)和β-丙内脂再灭活，用封闭饲养健康鸡群的蛋，安全有保障。为了防止儿童接种流感全病毒疫苗引起的发热反应，将病毒进行裂解，制成裂解疫苗取得很好的效果，可以在儿童中接种。一般认为，裂解疫苗的免疫效果不如全病毒疫苗。但由于裂解病毒的方法各不相同，目前国际上研制的禽流感疫苗，有全病毒的〔1，2〕也有裂解的〔3，4〕。故本研究设计了有全病毒和不同裂解程度的3种生产工艺，以比较它们的免疫效果。希望获得免疫效果较好的禽流感疫苗。从3种工艺疫苗的电镜形态观察，达到原设计的要求，即完整病毒；病毒裂解很细和不完整病毒或病毒碎片３种。从SDS-PAGE电泳的条带来分析，全病毒疫苗与裂解-2疫苗基本相似，裂解-3疫苗未见32KD左右的条带(M1蛋白)，表明它们之间存在差别，但3种疫苗的血凝素和核蛋白的条带均比较明显。经核酸扩增试验，均能扩增到禽流感病毒的基因片段，提示H5N1的核酸扩增可用于疫苗的鉴别试验。引发流感疫苗副反应的成分主要有内毒素、卵清蛋白和其他杂蛋白。因而疫苗质量的好坏主要取决以下4项指标，即内毒素、卵清蛋白、总氮、总氮与血凝素之比。国家标准〔5〕规定内毒素不高于200EU/ml（本实验为＜2EU/ml），卵清蛋白不高于2μg/ml（本实验为＜0125μg/ml），总氮不高于600μg/ml（本实验为＜100μg/ml，因配成30μg/ml疫苗，原液还要稀释4倍），总氮与血凝素之比不高于6（本实验为2左右）。比较可见，本研究设计生产的禽流感疫苗可达到进口普通流感疫苗质量。
〔1〕 John J，Treanor，M D，James D，et al.Safety and immunogenicity of an inactivated subvirion influenza A(H5N1) vaccine［J］.N Engl J Med，2006，354(13):1343-1351.
〔2〕 Lin J，Zhang J，Dong X，et al.Safety and immunogenicity of an inactivated adjuvanted whole-virion influenza A(H5N1) vaccine:a phase I randomised controlled trial［J］.Lancet，2006，368(9540):991-997.
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〔4〕 英国葛兰素史克.禽流感疫苗临床试验成功［EB/OL］.http://info.pharmacy.hc360.com/2006/04/07101739167.shtml.
〔5〕 国家药典委员会.流行性感冒疫苗制造及检定规程［S］.药典三部.北京：化学出版社，2005：19-23.
