抗环斑病毒转基因番木瓜55-1的PCR检测
【关键词】 ,转基因；番木瓜55-1；
摘要： 目的 建立对抗环斑病毒转基因番木瓜55-1进行品系鉴定的检测方法。方法 采用改良十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法及试剂盒方法进行番木瓜基因组DNA提取，根据番木瓜管家Papain基因和抗环斑病毒转基因番木瓜55-1品系的外源结构基因(35S-GUS)和调控基因(NOS-35S)序列设计合成特异性检测引物，采用PCR技术对抗环斑病毒转基因番木瓜55-1进行品系鉴定。结果 内源Papain基因PCR扩增结果表明，改良CTAB法及试剂盒方法都可用于番木瓜种籽及果肉的DNA提取。实验中合成的引物及建立的PCR反应体系、反应参数能特异性地扩增转基因番木瓜55-1的外源基因35S-GUS序列和NOS-35S序列。该方法的绝对检测低限为815×10-2ng，相对检测低限为014％。结论 本检测方法有较高的稳定性，能有效地对转基因番木瓜55-1进行品系鉴定，该方法的检测灵敏度可完全满足转基因食品标识管理定性检测的需要。
关键词： 转基因；番木瓜55-1；
PCRPCR for event-specific detection of transgenic virus resistant papaya 55-1
Abstract： Objective PCR assay was developed for event-specific detection of transgenic virus resistant papaya 55-1.Methods A developed Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide(CTAB) method and Qiagen DNeasy plant mini kit were used to extract DNA from papaya seed and fruit.Specific primers for PCR detection of papaya 55-1 were designed to amplify endogenous papain gene sequence and external segments,35S-GUS and NOS-35S,and corresponding detection methods were developed.Results Results of PCR amplification of papain gene indicated that both the developed CTAB method and Qiagen DNeasy plant mini kit were useful for DNA extraction from papaya seed and fruit.Results of amplification of the external segments (35S-GUS and NOS-35S) indicated that the developed method was useful to detect the transgenic virus resistant papaya line 55-1,and the absolute and relative limit of detection (LOD)of the method got to 8.15×10-2 ng and 0.14% respectively.Conclusion The developed PCR method can detect transgenic virus resistant papaya 55-1 specially and detective sensitivity can satisfy the need of qualitative detection for genetically modified foods.
Key words： genetically modified;papaya 55-1;PCR
番木瓜属热带亚热带重要水果，为有效控制番木瓜环斑病毒(PRSV)对番木瓜产业的威胁，1998年世界上第1个转基因番木瓜品系――抗环斑病毒转基因番木瓜55-1在美国和加拿大获准商业种植〔1，2〕。从此转基因番木瓜55-1以其独特的抗病优势被广泛种植，每年都有大量转基因番木瓜流入国际水果市场。本研究采用改良十六烷基-三甲基-溴化铵(CTAB）法及试剂盒方法进行番木瓜基因组DNA提取，根据番木瓜管家Papain基因和抗环斑病毒转基因番木瓜55-1品系的外源结构基因(35S-GUS)和调控基因(NOS-35S)序列设计合成特异性检测引物，采用PCR技术，建立对抗环斑病毒转基因番木瓜55-1进行品系鉴定的检验方法，为今后转基因番木瓜的标识管理及安全性评价提供技术支持。
1 材料与方法
11 材料 转基因番木瓜55-1种籽由香港政府化验所友情提供。市场抽检番木瓜购自深圳市翠竹万佳超市及深圳市田贝一路街边水果店。
12 仪器和试剂 MJR PTC-220扩增仪，SynGene Gene Genius凝胶成像系统，Eppendorf Biophotometer核酸蛋白分析仪。植物DNA提取试剂盒(美国Qiagen公司)；TaqDNA聚合酶、UNG酶(美国Promega公司)。
13 DNA提取
131 样品前处理 取番木瓜种籽，晾干后破碎至约05mm左右备用。番木瓜果肉直接破碎成泥，离心去水相后备用。
132 试剂盒DNA提取方法 采用DNeasy Plant Mini Kit试剂盒(美国Qiagen公司)，并按使用说明操作。
133 改良CTAB法 取100mg处理好的样品至2ml离心管中，加入500μl2％CTAB裂解液，65℃水浴30min。加入300μl氯仿／异戊醇(24：1)充分混合约5min，12000r／min，离心5min。取上清，加1／10量的10％CTAB液摇匀后再加入300μl氯仿／异戊醇，处理同前，离心后取上清，加等量CTAB沉淀液［1％CTAB，50mmol／LTris-HCl,pH80，10mmol／l乙二胺四乙酸(EDTA)］，摇匀，15min后12000r／min，离心10min，弃上清，加100μl高盐三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液(TE)和5μl10mg／mlRNA酶，55℃温浴10min，加2倍体积冷无水乙醇沉淀，洗涤2次，风干，50μlTE溶解。
14 核酸纯度及浓度测定 采用紫外分光光度法测定所提取的核酸的纯度和浓度。
15 PCR检测
151 引物 根据转基因番木瓜55-1品系的质粒图谱〔1〕设计和合成。Papain(211bp)I：5′GGGCATTCTCAGCTGTTGTA3′Ⅱ：5′CGACAATAACGTTGCACTCC3′;NOS35S(207bp)I：5′TTACGGCGAGTTCTGTTAGG3′Ⅱ：5′CATGTGCCTGAGAAATAGGC3′;35SGUS(250bp)I：5′CCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATA3′Ⅱ：5′TCGTTAAAACTGCCTGGCAC3′。
152 反应体系 25μl反应液中含10×PCR Buffer25μl，25mmol／L MgCl230μl，10mmol／L dNTP(for each)05μl，mixed primers(15μmol／L for each)04μl，Taq酶(5U／μl)02μl，UNG酶(1U／μl)03μl，DNA模板(10～50ng/μl)5μl。
153 反应条件 5℃3min；95℃预变性10min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，40个循环；72℃延伸7min。
16 凝胶电泳检测 DNA提取液以08％琼脂糖进行凝胶电泳检测，以确定DNA提取结果；PCR产物以15％琼脂糖进行凝胶电泳检测，以确定PCR扩增结果。
17 检测低限的测定 为测定该方法对转基因番木瓜551的检测低限，采用紫外分光光度法测定试剂盒法提取的100％转基因番木瓜55-1种籽的DNA提取液的DNA浓度，然后对该DNA提取液以3倍为梯度进行稀释，共稀释7个梯度，使最终稀释倍数达2187倍。各取5μl稀释样品作为模板，进行35S-GUS序列PCR扩增。
18 实验对照 以蒸馏水代替样品作为DNA提取空白对照；以蒸馏水代替样品作为模板作为PCR空白对照。
2 结果
21 样品DNA提取结果 本研究采用改良CTAB法和试剂盒法分别对市售番木瓜的种籽和果肉及转基因番木瓜种籽进行DNA提取。DNA提取液的08％琼脂糖凝胶电泳结果显示这2种方法对番木瓜种籽的提取结果均较果肉的提取结果理想，在电泳图像上种籽的提取条带明显可见，但果肉未见明显的提取条带。但对内源Papain基因的扩增结果显示，2种方法用于提取番木瓜种籽和果肉DNA均出现明显的扩增条带见图1。
1～3，10～12:市售木瓜果肉；4～9:市售番木瓜种籽；13：转基因番木瓜55-1种籽；14：提取空白对照;15：PCR空白对照；16：分子量；Marker:1～6分子量Marker；1～6：改良CTAB法；7～14：试剂盒法
图1 内源管家基因Papain PCR扩增结果（略）
22 外源基因PCR检测结果 采用依据转基因番木瓜55-1（CaMV）35S启动子和外源结构基因GUS(β-glucuronidase gene)序列设计合成的35S-GUS序列引物和依据其CaMV 35S启动子和NOS终止子序列设计合成的NOS-35S序列引物对35S-GUS序列和NOS-35S序列进行扩增，见图2。
A：35S-GUS序列PCR扩增结果 1～3：市售番木瓜种籽；4：提取空白对照；5：转基因番木瓜55-1种籽；6：PCR空白对照；7：分子量
Marker; B:NOS35s序列PCR护增结果 1～3：市售番木瓜种籽；4：转基因番木瓜55-1种籽；5：提取空白对照；6：PCR空白对照；7：分子量Marker(bp)
图2 35S-GUS、NOS-35S序列PCR扩增结果（略）
23 检测低限的测定结果 经紫外分光光度法测定，试剂盒法提取的100％转基因番木瓜55-1种籽的DNA提取原液的DNA浓度为119ng／μl。DNA提取液梯度稀释后35S-GUS序列扩增。在稀释倍数<2187的各点样孔下方都可见明显的扩增目的条带，只有2187倍稀释液点样孔下方的扩增条带较模糊。而且多次重复试验结果基本一致。后结果表明，该方法的绝对检测低限为815×10-2ng，其相对检测低限为014％。
1：分子量Marker(bp);2:PCR空白对照；3：DNA提取原液；4：3倍稀释液；5：9倍稀释液；6：27倍稀释液；7：81倍稀释液；8：243倍稀释液；9：729倍稀释液；10：2187倍稀释液
图3 番木瓜55-1种籽的35S-GUS序列扩增结果（略）
3 讨论
Papain是番木瓜4种半胱氨酸蛋白酶中的1种，这4种半胱氨酸蛋白酶都属于蛋白酶Papain家族，这些蛋白酶具有高度一致性。因此，本研究以PCR扩增内源Papain基因作为反应样品DNA提取效果的方法之一。番木瓜DNA提取结果表明改良CTAB法和试剂盒法都可以用于提取番木瓜基因组DNA，且取样部位可以是种籽或果肉，但2种提取方法的结果均表明番木瓜种籽的DNA提取结果较果肉更理想。另外，紫外分光光度法对DNA提取液的检测表明改良CTAB法提取的样品DNA含量略高，但纯度不及试剂盒法。35S-GUS和NOS-35S序列扩增产物琼脂糖凝胶电泳图像显示，在转基因番木瓜55-1种籽点样孔下方约250和207bp位置处出现扩增条带，而提取空白对照和PCR空白对照结果均为阴性，提示实验中所使用的引物及PCR反应体系，反应参数能特异性地扩增转基因番木瓜55-1的外源基因35S-GUS序列和NOS-35S序列。经多次重复试验证明，本研究建立的PCR检测方法有较高稳定性，能有效地对转基因番木瓜55-1进行品系鉴定。而抽检的市场番木瓜在相应位置未见阳性扩增条带，表明市场抽检的番木瓜不是55-1品系转基因番木瓜。本研究由于以100％转基因番木瓜为测定对象，所以可同时测定绝对检测低限和相对检测低限。结果表明，该方法的检测低限比目前国际上设定的转基因成分标识的最低限量低7倍，可完全满足转基因产品标识管理定性检测的需要。
〔1〕 Erika M,Wall TS,Lawrence MJ,et al.Detection and identifiation of transgenic virus resistant papaya and squash by multiplex PCR［J］.Eur Food Res Technol,2004,219:90-96.
〔2〕 Maureen MMF,Richard MM,Dennis G,et al.Virus resistant papaya plants derived from tissues bombarded with the coat protein gene of papaya ringspot virus［J］.Biotechnology,1992,10:1466-1472.
