牛磺酸对大鼠视网膜超微结构损伤保护作用
【关键词】 ,牛磺酸；N
摘要： 目的 观察牛磺酸对N甲基D天冬氨酸(NmethylDaspartate，NMDA)兴奋毒性引起的大鼠视网膜组织结构及超微结构损伤的保护作用。方法 在大鼠玻璃体腔内每眼注射5μl 4mmol/L NMDA造成视网膜兴奋毒性损伤模型，20只成年雄性SD大鼠随机分为4组：正常对照组；NMDA组；NMDA+牛磺酸干预组(腹腔注射25mg/kg牛磺酸)；磷酸盐缓冲液(PBS)对照组。玻璃体注射后第4d，测量视网膜总厚度及内层厚度并用透射电镜观察视网膜超微结构。结果 NMDA使大鼠视网膜总厚度尤其是视网膜内层厚度变薄(P＜0001)，超微结构显示内核层及节细胞层神经元发生变性改变，25mg/kg牛磺酸干预可有效保护视网膜组织结构，削弱NMDA引起的视网膜超微结构损伤。结论 牛磺酸在体内可有效保护NMDA引起的视网膜组织结构及超微结构损伤。
关键词： 牛磺酸；N甲基D天冬氨酸；兴奋毒性；视网膜；超微结构
Protective effects of taurine against retinal ultrastructural damage on rats
Abstract： Objective To observe whether taurine has protective effects against NmethylDaspartate (NMDA)induced excitototxicity,especially in retinal histo pathological structure and ultrastructure in rat.Methods A rat model of retinal excitotoxicity injury induced by intravitreal injection of 5μl 4mmol/L NMDA in one eye.Twenty adult male SpragueDawley rats were divided into four groups:normal control,intravitreal injection of PBS control,NMDA group,NMDA injection and taurine treated group (intraperitoneal injection with 25mg/kg taurine).At the 4th d of intravitreal injection,the retinal damage was evaluated by measurement of the thickness of whole retina and inner retinal layer,and observation of retinal ultrastructure.Results After injection of NMDA,the overall thickness of retina were reduced (P＜0001),especially in inner retinal layer (P＜0001)compared to controls.Degenerative changes were observed in neural cells of inner nuclear layer and ganglion cells layer by electron microscopy.These damages can be prevented by 25mg/kg taurine effectively.Conclusion Taurine treatment can effectively prevent the damage of NMDAinduced retinal histopathological structure and ultrastructure in rat.
Key words： taurine;NmethylDaspartate(NMDA);excitotoxicity;retina;ultrastructure
兴奋性氨基酸(EAA)引起的兴奋毒性是糖尿病视网膜病变〔1〕、青光眼、视网膜变性等疾病的视网膜神经元损伤及死亡的主要机制之一。体内研究表明，视网膜的兴奋毒性主要由N甲基D天冬氨酸(NmethylDaspartate,NMDA)受体介导〔2〕。牛磺酸(Taurine)是视网膜含量最丰富的游离氨基酸，近年来发现，牛磺酸可以保护培养的小脑颗粒细胞对抗兴奋毒性损伤〔3〕。本实验通过在大鼠玻璃体内注射NMDA制备视网膜兴奋毒性损伤模型，观察牛磺酸对NMDA诱导的视网膜组织结构及超微结构损伤的保护作用。
1 材料与方法
11 实验动物及视网膜NMDA兴奋毒性损伤动物模型的建立 成年雄性SpragueDawley大鼠20只，体质量200～250g(第三军医大学野战外科研究所实验动物中心)，实验动物质量合格证号：SCXK(军)2002008。大鼠腹腔注射速眠新注射液01ml/100g(长春军需大学兽医研究所)麻醉，5%托品酰胺散瞳，1%利多卡因进行角膜表面麻醉，用微量注射器从颞上方巩膜距角膜缘外3mm处进针，见针尖到达玻璃体中后部后，缓慢注入5μl 4mmol/L的NMDA〔2〕。洁霉素滴眼预防感染。眼瞎大鼠弃去。
12 实验分组 20只大鼠按随机数字表法分为4组：(1)正常对照组；(2)NMDA组；(3)NMDA+牛磺酸干预组；(4)磷酸盐缓冲液(PBS)对照组；每组5只大鼠。正常对照组不进行任何处理；NMDA组为上述模型组；牛磺酸干预组于眼内注射NMDA前1h及其后每天腹腔注射牛磺酸(25mg/kg〔4〕)，共注射3d；PBS对照组于玻璃体内注射5μl 01mol/L PBS。玻璃体注射后第4d观察指标变化。NMDA、牛磺酸(美国Sigma公司)，用无菌01mol/L PBS稀释。
13 视网膜组织病观察及视网膜厚度测量 腹腔注射2ml/100g 03%戊巴比妥钠处死大鼠，迅速摘取右眼，去除前节、晶状体及玻璃体，将眼杯用10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，经视乳头切片(5μm)，苏木精伊红(HE)染色，观察视网膜组织结构并照相，LEICA Q WIN图像分析软件于距视乳头中心15mm处双侧测量视网膜全层及视见网膜内层(包括内核层、内网状层、节细胞层和神经纤维层)厚度，每只眼球取6张切片，每组5只大鼠结果求平均值。
14 视网膜超微结构观察 按前法处死大鼠，摘取左眼，将眼杯迅速置于4℃预冷的3%戊二醛固定，常规1%钅我酸固定，系列丙酮脱水，环氧树脂浸透包埋，经光镜定位后行超薄切片，于TENCAI10 PHILIPS透射电镜下观察视网膜各层细胞的超微结构。
15 统计分析 采用SPSS统计软件处理，组间比较用单因素方差分析。
2 结果
21 视网膜组织病理结构改变及视网膜厚度测量(表1)
表1 各组视网膜总厚度及视网膜内层厚度测量结果（略）
HE染色及视网膜厚度测量结果显示，玻璃体内注射NMDA后第4d，与未注射眼视网膜相比，视网膜总厚度变薄(P＜0001)，尤以视网膜内层厚度变薄明显(P＜0001)，节细胞数有减少，而视网膜内、外段及外核层改变不明显。牛磺酸干预使视网膜总厚度(P=0017)及内网状层厚度(P=0001)较模型组增厚，节细胞的丢失减少。表明牛磺酸干预可有效保护NMDA兴奋毒性对视网膜组织病理结构改变。
22 玻璃体注射NMDA及牛磺酸干预对视网膜超微结构的影响 透射电镜观察发现，玻璃体注射NMDA后第4d，视网膜内核层细胞及节细胞超微结构发生改变。镜下可见，NMDA组：视细胞胞体无明显病变，色素上皮细胞及盘膜正常，内核层神经元线粒体中、重度肿胀，嵴消失甚至空泡样变，内质网严重扩张(图1)，节细胞部分轴突明显肿胀，视神经纤维明显肿胀甚至解体(图2)，整个内核层神经元及节细胞表现为变性改变。牛磺酸干预组：内核层细胞有轻度线粒体肿胀及内质网扩张，节细胞超微结构正常，仅部分节细胞见轻度线粒体肿胀和内质网扩张(图3)，视神经纤维层轴突肿胀不明显(图4)，牛磺酸组超微结构改变较NMDA组明显减轻。
图1 NMDA组的内核层细胞(×7000)（略）
图3 牛磺酸干预组的节细胞(×7000)（略）
图2 NMDA组视神经纤维层(×4200)（略）
图4 牛磺酸干预组视神经纤维层(×2900)（略）
3 讨论
目前认为EAA引起的兴奋毒性是糖尿病视网膜病变、青光眼、视网膜缺氧等的视网膜神经元死亡的主要机制之一。研究表明〔2〕，视网膜内层神经元的兴奋毒性损伤主要由对NMDA受体的过度刺激引起，NMDA受体的各亚单位在视网膜主要见于内网状层的突触后神经元，即无足细胞和节细胞〔5〕。Lam等〔6〕用玻璃体内注射NMDA的大鼠模型发现，注射18h后内核层和节细胞层出现大量细胞凋亡。腹腔注射NMDA受体拮抗剂-MK801能有效预防NMDA对视网膜细胞的损伤〔7〕。将NMDA受体拮抗剂用于预防视网膜兴奋毒性是一种值得探索的方向，但由于NMDA受体同时介导许多正常的生理功能，其拮抗剂用于人体可能对中枢神经系统产生多种副作用，使其临床应用受到限制〔8〕。牛磺酸是一种正常存在于人体多种组织的游离氨基酸，目前公认牛磺酸是一个调节及降低神经细胞内Ca2+水平的强有力因子〔9〕。有研究提示，牛磺酸可通过防止或降低谷氨酸诱导的胞内Ca2+水平的升高而保护培养的大脑神经元〔3〕。我们研究发现，牛横酸可保护大鼠糖尿病视网膜病变的组织结构及超微结构损伤〔10〕。本实验发现，牛磺酸在体内可拮抗NMDA兴奋毒性对视网膜组织结构及超微结构的损伤。由于目前未发现较高剂量的牛磺酸摄入对人体有负面影响，提示将其用于预防EAA兴奋毒性引起的视网膜神经元损伤可能有较好的临床应用前景。
〔1〕 Kowluru RA，Engerman RL，Case GL,el at.Retinal glutamate in diabetes and effect of antioxidants［J］.Neurochem Int,2001,38(5):385-390.
〔2〕 Moncaster JA,Walsh DT,Gentleman SM,et al.Ergothioneine treatment protects neurons against NmethylDaspartate excitotoxicity in vivo rat retinal model［J］.Neurosci Let,2002,328(1)：55-59.
〔3〕 Chen WQ,Jin H,Nuyen M.Role of taurine in regulation of intracellular calcium level and neuroprotective function in cultured neurons［J］.J Neurosci Res,2001,66(4):612-619.
〔4〕 许红霞，糜漫天，徐朝霞.牛磺酸对大鼠视网膜谷氨酸兴奋毒性的防护作用研究［J］.营养学报，2005，27(2)：114-118.
〔5〕 Fletcher EL,Hack I,Branstatter JH,et al.Synaptic localization of NMDA receptor subunit in the rat retina［J］.J Comp Neurol,2000,420:98-112.
〔6〕 Lam TT,Ablen AS,Kwong JMK,et al.NmethylDaspartate(NMDA)induced apoptosis in rat retina［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci,1999,40:2391-2397.
〔7〕 Sun Q,Ooi VE,Chan SO.NemthylDaspartateinduced excitotoxicity in adult rat retina is antagonized by single systemic injection of MK801［J］.Exp Brain Res,2001,138(1):37-45.
〔8〕 Ikonomidou C,Turski L.Why did NMDA receptor antagonists fail clinical trials for stroke and traumatic brain injury?［J］Lancet Neurol,2002,1(6):383-386.
〔9〕 Foos TM,Wu JY.The role of taurine in the central nervous system and the modulation of intracellular calcium homeostasis［J］.Neurochem Res,2002,27(1-2):21-26.
〔10〕 徐朝霞，糜漫天，许红霞.牛磺酸对早期糖尿病大鼠视网膜超微结构的影响［J］.公共卫生，2004，20(5)：554-556.
