高效液相色谱法检测去氧氟尿苷注射液有关物质
【关键词】 去氧氟尿苷；注射液；有关物质；高效液相色谱法
【Abstract】 Objective To establish a HPLC method for determination of the deoxifluridine injection related substance.Methods The separation and analysis was performed on a C18 column(4.6mm×150mm,5μm),the mobile phase consisted of water-acetonitrile -acetic acid buffer solution(pH6.1)(58:32:0.5).The flow rate was 1.0ml/min. The detection wavelength was set at 269nm.Loaded volume was 20μl. Results A good linear relationship was obtainted in the deoxifluridine injection 5.35~35.22μg/ml(r=0.9999,n=5).Conclusion The proposed method is sensitive ,accurate and simple ,and can be used for the determination of related substance of deoxifluridine injection.
【Key words】 deoxifluridine; injection; related substance; high performance liquid chromatography(HPLC)
去氧氟尿苷（Deoxifluridine）为5-氟尿嘧啶的衍生物，在肿瘤组织内受嘧啶核苷磷酸化酶的作用转化为游离的5-氟尿嘧啶而显示抗肿瘤作用。由于这种酶的活性在肿瘤组织内较正常组织为高，且专一性强，故本品在肿瘤内转化速度快、浓度高，对肿瘤具有较高的选择作用。临床用于胃癌、大肠癌、乳腺癌、子宫颈癌、膀胱癌。去氧氟尿苷疗效高，毒性小，是一个具有特色的、国际公认的较好的抗癌药。本研究采用HPLC法［1，2］，建立了去氧氟尿苷注射液中有关物质的测定方法。
1 仪器与试药
Agilent 1100高效液相色谱仪(四元泵，自动进样器，紫外检测器，惠普色谱工作站，真空脱气机)（美国安捷伦公司）；去氧氟尿苷对照品（江苏省药品检验所标定），含量99.6%，供试品（自制，批号：060114、060115、060116），甲醇（色谱纯），其余试剂为分析纯，水为纯化水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱： Diamonsil C18柱（4.6mm×150mm，5μm）；流动相：水-乙腈-醋酸缓冲液（pH6.1，即取醋酸钠10.92g，加水100ml，用冰醋酸调至pH6.1）（58：32：0.5）；流速：1.0ml/min；检测波长：269nm；进样量：20μl；柱温：25℃。在上述色谱条件下，去氧氟尿苷的保留时间约为4.3min，理论板数不低于1000，去氧氟尿苷与相邻物质峰的分离度大于1.5。
2.2 专属性试验 精密量取去氧氟尿苷注射液适量，用水稀释制成约含去氧氟尿苷0.1mg/ml的供试品溶液，进样20μl，记录色谱图。另精密称取去氧氟尿苷对照品适量，用水溶解并稀释制成浓度为0.1mg/ml的对照品溶液，进样20μl，记录色谱图。取空白溶剂水及流动相直接进样20μl，记录色谱图。由色谱图可见，溶剂对去氧氟尿苷测定无干扰（见图1～3略）。
2.3 有关物质线性关系试验 精密称取于105℃干燥至恒重的去氧氟尿苷对照品约50mg于50ml量瓶中，加水适量，振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液1.0ml、1.0ml、1.0ml、1.0ml、0?5ml，依次置于25ml、50ml、100ml、200ml、200ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。精密量取各浓度溶液20μl，注入液相色谱仪，记录峰面积（A），以峰面积A对浓度C进行线性回归，得回归方程为A=34581C+518.17（r=0.9999，n=5），线性范围为5?35～35.22μg/ml。
2.4 最低检测限 取“线性关系”项下的对照品溶液，稀释至约4μg/ml，进样20μl，测定色谱系统基线。按信噪比为3，测得去氧氟尿苷检测限为36ng/ml。
2.5 精密度试验 取去氧氟尿苷对照品适量，精密称定，加水溶解并稀释至约0.1mg/ml的溶液，进样20μl，重复进样6次，记录色谱图，结果峰面积的RSD为0.46%，表明该溶液进样精密度良好。
2.6 稳定性试验 取上述精密度试验项下的样品溶液，于室温下放置0、2、4、6、8、10和12h后，分别进样20μl，峰面积的RSD为0.53%，表明该溶液12h内稳定。
2.7 回收率的测定 精密称取去氧氟尿苷对照品适量，按处方比例加水制成80%、100%、120%共3种浓度的溶液，按上述色谱条件测定。以加入量与测得量的比值，回收率。结果低、中、高3 种浓度溶液的回收率分别为99.8%、100.1%、99.6%；RSD分别为0.56%、0.48%、0.62%，平均回收率（n=9）为99.8%。
2.8 去氧氟尿苷注射液中有关物质的检测 精密量取去氧氟尿苷注射液适量（约相当于主药25mg），置于250ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试溶液；精密量取供试溶液1ml，置于100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。取对照溶液20μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的10%～25%；另精密量取上述两种溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，量取各杂质峰峰面积之和，不得大于对照溶液主峰面积1.0%。
3 讨论
（1）本试验采用HPLC法测定去氧氟尿苷注射液中的有关物质，操作简便、快速，测定结果准确可靠，从而能有效地控制该药的质量。（2）在流动相的选择上笔者比较了甲醇-水系统、乙腈-水系统、甲醇-磷酸盐缓冲液系统、乙腈-磷酸盐缓冲液系统等，发现去氧氟尿苷与有关物质不能很好地分离，且色谱图中主成分峰有明显的脱尾现象，方法不合理。后来试加入醋酸缓冲液，结果能使去氧氟尿苷与有关物质达到良好的分离，并消除了主峰脱尾现象。（3）在主药的稀释溶剂选择上，考虑到去氧氟尿苷易溶于水，笔者比较了用流动相和水作为溶剂进行了检测，发现两种供试样品的色谱图中，主峰与有关物质都能达到很好的分离，且检测结果无明显差异。为方便操作和节约成本，笔者选用纯化水作为稀释溶剂。
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1 国家药典委员会.药典,2000年版.北京：化学出版社,2000,2部.
2 郝万红?HPLC法测定去氧氟尿苷有关物质.齐鲁药事,2006,25(4):218-219.
