土壤环境基因组技术及其在新药发现中的应用

        作者：闫珠君 崔晓龙 李铭刚 李一青 彭谦 文孟良

【关键词】  药物发现；,,环境基因组；,,未被纯培养微生物；,,土壤DNA文库；,生物活性物质

       摘要： 土壤是微生物最重要的生境，土壤微生物具有极大的多样性。然而传统培养技术只能得到约1%的微生物纯培养，其余都是未被纯培养微生物。利用土壤环境基因组技术，可以把未被纯培养微生物的基因克隆到载体中并在宿主中进行表达，获得比已培养微生物丰富的代谢产物多样性，这为我们发现新颖结构先导化合物以及新药开辟了新的道路。本文介绍应用环境基因组技术构建土壤DNA文库的思路和方法。

　关键词： 药物发现；　 环境基因组；　 未被纯培养微生物；　 土壤DNA文库； 生物活性物质

　    Soil metagenomics and its application for new drug discovery

　　    ABSTRACT Soil is the most important habitat for microbes. Soil microbes are of considerable diversity. However, only about 1% of soil microbes are cultivable with traditional techniques, others are all uncultured microorganisms. The gene of uncultured microorganisms can be cloned to vectors and expressed in host by soil metagenomics. Highly diversified metabolites can be obtained than those obtained from cultured microorganisms, which pave the way of discovering lead compounds with novel structure or even new drugs. In this review, the idea and method of constructing a soil DNA library by metagenomics is introduced.KEY WORDS Drug discovery; Metagenomics; Asyet uncultured microorganisms; Soil DNA library; Bioactive substance

     自从1928年Alexander Fleming发现点青霉中存在抗菌物质后，在微生物次级代谢产物中寻找药物就一直是药物发现的热点之一。传统的微生物药物筛选方法是从环境中分离培养微生物，并对纯培养进行发酵以获得特定生理条件下的次级代谢产物，最后对产物中的活性成分进行分离、纯化和表征，以获得有临床价值的先导化合物。在经历了大规模抗生素筛选的黄金时代以后，微生物药物发现进入低速阶段。抗生素滥用导致的耐药性问题使得人们努力从微生物中寻找新的抗生素，尤其是具有新结构的抗生素先导化合物。然而，传统分离培养方法的局限性，从环境中分离得到新类群越来越困难，即使分离得到的微生物，菌株的排重问题也难以得到解决。传统技术越来越难以增加微生物次级代谢产物的多样性，也不能满足高通量筛选的需求。决定微生物次级代谢产物多样性的因素主要有：待筛选物种数量及其多样化程度；物种的新颖性及其产生新次级代谢产物的潜力［1］。天然产物的复杂性和新颖性永远超乎人们的想象，环境中存在的微生物多样性也远远超出人们的常识。实际上，可培养的微生物只占整个微生物类群很小的一部分，未被纯培养微生物(asyet uncultured microorganism)蕴藏着一大批未开发的药物资源。通过环境基因组(metagenomics)的方法，即从土壤样品中提取总DNA，纯化，部分降解，把酶切片断放入载体中，在诸如大肠埃希菌等容易发酵的微生物中表达。人们已开始探索这一未知领域，并报道了由新颖序列编码的表达酶活性和抗生素活性的克隆［2］。

    1 土壤中微生物的多样性

　　土壤微生物是最有价值的天然产物源泉之一，它们提供了许多上十分重要的抗生素以及生物催化剂。芽孢杆菌、丝状真菌、放线菌以及粘细菌都有惊人的产生多样化次级代谢产物的能力。Hammond估计地球上的微生物物种多达16×109，广泛分布于各种生态系统中［3］，其中，土壤无论从微生物数量和种类上都是首屈一指的生境。运用重组动力学的方法，Torsvik等估计1克土壤中约有大于4000种不同的微生物［4］，而这个数字到2002年已增长为10000种［5］。但是，运用现有的技术，只有02%～2%的土壤微生物是可培养的［6］，重复发现的机率极高，例如放线菌中抗生素重复发现的概率已达到99%［7］。对于细菌来说，现有的培养技术无法满足微生物生长需求是一个重要原因，许多微生物需要借助土壤中特殊的营养成分、土壤颗粒或者不同细胞间的信号来完成重要的生理功能；对于真菌，取样不足可能导致了人们对其多样性的低估。幸运的是，土壤微生物资源并未开发殆尽，人们正在努力寻找开发未被纯培养微生物或难培养微生物的方法。Button等用稀释培养的方法培养了贫营养水环境中的细菌，并证明添加营养刺激少数微生物生长的同时，抑制了绝大多数微生物的生长［8］。还有人模拟微生物的自然环境来优化离体的纯培养物分离。这些方法一定程度上证明了未被纯培养微生物的广泛存在，同时也启发了研究未被纯培养微生物的新思路。

    2 环境基因组技术

　随着基因组技术的发展，人们开始用分子生物学的方法来研究微生物间的进化关系和遗传信息的功能关系。环境基因组又称多源基因组或宏基因组，是指从环境中提取总的DNA，对其进行遗传学和功能学的研究。优点是不但可以原始地反映环境样品中所有生物的遗传多样性，避开难培养这一技术瓶颈，而且可以把细胞外的DNA一并研究。通过环境基因组的方法可以获得越来越多的DNA序列，且大都是新颖的未被纯培养微生物的序列。运用环境基因组序列不但可以使我们逐渐了解微生物群落功能的复杂性，以及微生物间的相互作用关系，而且可以使我们深入了解未被纯培养微生物的生理和生态特征［9］。研究药物发现相关的新颖基因，自然要把目标锁定在环境基因组中编码新颖次级代谢产物的基因上。在土壤总DNA中，编码次级代谢产物的基因经常是成簇存在的，与同一个次级代谢产物相关的基因的生物合成区域和调节区域经常是紧密相连的。这些相连的基因使得克隆到载体中整个次级代谢产物途径基因是一个连续的片段。在药物发现中，生物合成基因和抗性基因也是连在一个片段上的，对于有毒的代谢产物，宿主可以通过共表达的抗性基因带来的抗性机制来避免毒性［2］。这一特点不但简化了对外源片段进行剪切和修饰程序，而且使重组子的筛选更加方便，无疑为功能基因的克隆和表达提供了便利。应用土壤环境基因组技术发现药物的基本思路是：通过从土壤中的环境基因组(一般是土壤微生物总DNA)建立DNA文库［10］，将其克隆到实验室条件下可以培养的宿主(一般为通用性较强的大肠埃希菌)中，进一步研究未被纯培养微生物次级代谢产物的化学多样性(图1)。这种新方法要求必须从土壤中分离纯化DNA片段，并与大小合适的筛选载体和表达载体连接以实现克隆。载体在插入大片段的DNA后必须保持稳定性，才能在宿主中实现稳定和大量的表达。

    3 土壤DNA的分离提取

　与其他基因工程技术不同，土壤环境基因组技术所需要的DNA片段不是来自已知菌中已熟知的基因片段或基因簇，而是来自完全未知的土壤样品中，对其可能具有的潜在功能也并不知晓。从土壤中提取和纯化微生物的总DNA是关键性的第一步，因为DNA的纯度和片段的大小直接决定了后续基因操作能否顺利进行。从土壤中提取DNA需要体现完整的基因多样图1 土壤DNA文库的建立步骤性，其方法主要有两种：(1)对土壤样品中的原位细胞进行裂解后直接提取核酸物质，然后对DNA进行纯化［11］；(2)从土壤样品中分离细菌细胞，再对细胞进行裂解和纯化［12～14］。直接裂解提取环境总DNA的方法在以往的几十年中已经得到了应用，这种方法处理时间短，DNA的产率较高。首先通过物理、化学的方法破坏细胞壁和细胞膜。物理方法主要有珠磨匀浆、煮沸、微波、冷冻解冻循环和超声波裂解法［2］，物理方法破坏较小的细胞和孢子［15］效率很高，但同时也导致大量DNA链的断裂［16，17］；化学裂解的试剂和条件包括SDS+加热、渗压休克、NaOH、溶菌酶、蛋白酶K或肽酶等处理［2］，运用最多的还是SDS+加热，佐以螯合剂EDTA和各种Tris或磷酸缓冲液［18］。裂解后释放出来的DNA需要经过提取和纯化，这是关键性的步骤。土壤中的多酚类物质(尤其是腐殖酸)可随DNA一起纯化，抑制限制性酶的活性和PCR扩增［19］，以及改变定量杂交的信号［20］，还可使生物分子变性，因此在纯化过程中必须予以去除。有机溶剂、羟磷灰石柱、CsCl密度梯度离心都可用于去除腐殖酸，效果较好的当推聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。在多数研究中，直接裂解的方法都不能产生长度<20kb的DNA片段，如果用于构建插入片段较长的环境基因组文库，这种方法显然不足以胜任［21］。微生物细胞提取法主要步骤：(1)土壤颗粒的悬浮；(2)根据沉降速度、密度或者两者的不同从土壤颗粒中离心获取细胞；(3)提取细胞的裂解；(4)DNA的纯化［21］。悬浮的方法主要有器皿搅拌悬浮、旋转捣碎、超声波、震荡悬浮等，以前两者的效果为佳。化学方法常与物理悬浮方法相结合，但也带来一些负作用。离心需要经过低速和高速两个阶段，前者可除去土壤碎片、真菌菌丝体和较重的土壤颗粒［22］；后者除去一些非细胞物质和土壤污染物(如腐殖酸)。提取细胞的降解方法与直接降解中所用的方法类似，氯化铯溴化乙啶平衡梯度离心的方法已成功地用于大片段DNA(>48kb)的纯化［23，24］。直接裂解获得的DNA较完整，得率高，工作量小，但DNA易被剪切，含有污染物，为胞内胞外混合的基因组。与之相比，较费时的间接降解指向特定的原核生物类群，可以获得高纯度和高分子量的DNA［21］。

    4 土壤DNA文库的构建

　用限制性内切酶部分降解从土壤中纯化后的环境基因组DNA。典型大小片断的选择是通过脉冲场凝胶电泳完成，待酶切的DNA片段大小需要比插入片段至少长3倍，即如果需要较大的插入片段(>100kb)，就需要几百kb的DNA，但如此长的DNA极易断裂，所以需要不断的使用修饰的方法来减少降解过程的步骤。Quaiser等用钝化末端克隆的方法在载体pEpiFOS中建立了一个土壤环境基因组文库，文库中有25×104个克隆，随即插入片段长度从325kb到435kb不等［2］。由于编码次级代谢产物合成的基因通常成簇存在，大小从十几kb至上百kb不等，所选用的载体也不同。克隆土壤环境基因组DNA的载体包括质粒、粘粒和人工染色体(BAC或YAC)。质粒和粘粒适合插入长度适中的片断(38～52kb)，其克隆效率较高。克隆大片段DNA必须选用BAC作为载体，虽然效率较前者低，但可携带>100kb的DNA片段，并在宿主细胞中稳定保持1～2个拷贝。一个运用比较成功的BAC载体是pBeloBAC11，它具有2个选择性克隆标记：基于颜色的重组体筛选基因Lac Z和氯霉素抗性基因。此外，它有三个独特的克隆位点，位于T7和SP6启动子的侧面，NotⅠ切割位点的两侧。pBeloBAC11的调节基因包括oriS和repE，它们可以介导F因子的单向复制，parA和parB保持每个细胞中的拷贝数为1～2。通过电穿孔转化大肠埃希菌，人们已成功的用这一载体构建了土壤环境基因组文库［25］。大多数环境基因组文库选择大肠埃希菌作为克隆和表达的宿主，优点在于具有较高的转化效率，产生的初级代谢产物简单，不会对异源次级代谢产物的表达产生影响，易于扩大发酵规模。应用最广泛的是一类称为DH10B的大肠埃希菌突变株［26］；BAC用于原核生物中异源基因的表达也有报道。用革兰阳性菌蜡状芽孢杆菌的基因组DNA在大肠埃希菌构建BAC文库。纯培养的蜡状芽孢杆菌产生的次级代谢产物中检测到具有10种生物活性，在大肠埃希菌BAC文库里发现其中的6种，包括脂肪酶、氨苄西林抗性、淀粉水解和橙色素的分泌［27］；其他宿主如链霉菌和芽孢杆菌的研究近年也有报道［28］，提示开发可以在大肠埃希菌和其他宿主之间穿梭的载体，无疑为扩大宿主系统和代谢背景，增加药物发现的几率创造了条件。

    5 土壤环境基因组文库的筛选方法

　从环境基因组文库中筛选具有生产新颖化合物潜力的重组子主要有2种策略：基于功能的筛选和基于序列的筛选。基于功能的筛选需要借助自动取液和滴液机器人，应用高通量筛选技术对重组子产生的代谢产物生物活性进行测定。迄今，人们已在土壤环境基因组文库检测到了2种生物活性：酶活性和抗生素活性，分离到的异源基因产物有：indirubin［29］、violacein［7］、dexyviolacein［7］、tyrosine derivatives［7］和turbomycins A/B［7］(图2)。应用高通量筛选进行的功能筛选检出率不高，几千个克隆中只能检测出不到10个阳性克隆［30～32］，其原因除了检测手段的灵敏度之外，更重要的是异源表达的障碍使得转录、翻译以及蛋白包装和分泌难以在宿主中进行。这一问题将随着更优的载体和宿主的获得以及更灵敏的检测手段的开发而得以解决。

    产物的结构式 基于序列的筛选着眼于能够编码有价值性状的新颖基因。全序列测定和随机序列测定对发现新基因都是有意义的，但前者用于研究微生物群落的生态关系意义更大，而后者则具有更强的针对性。例如最近人们应用鸟枪法研究萨加索海域的环境基因组，不但深入研究小生境的基因组结构，也发现了很多有价值的生物合成基因［33］。通过DNA微阵列技术寻找环境基因组序列中的有用片段也是一种全新的筛选技术，它可以快速有效的识别和描述许多菌落的特征，并可应用于大量保守基因的分离［34］。通过序列分析，人们可以发现许多新颖的序列，这些序列为我们发现结构特殊的次级代谢产物、乃至药物创造了条件。例如编码Ⅰ型或者Ⅱ型聚酮类物质的酶基因就是链霉菌合成聚酮类抗生素的关键基因［35，36］。

    6 展望土壤环境基因组技术用于药物发现研究，可以建立一系列有应用价值的DNA文库。迄今为止，已经从环境基因组中发现了大量的编码生物技术中有用的酶基因甚至是整个生物合成途径基因。将来的工作将集中于如何将这些新颖基因及其产物整合到生物合成过程中去，以达到优化原有代谢途径或者创造全新的代谢途径。然而，环境基因组中新颖基因的大量发现也导致了一些技术瓶颈的出现。如何在保证基因片段长度的同时增加总DNA的得率和纯度，如何提高目的基因在异源宿主系统中的表达效率，如何开发除大肠埃希菌之外的其他原核和真核宿主都是亟待解决的问题。用环境基因组技术研究药物发现具有相当广阔的前景，但面对众多的的未被纯培养微生物资源，探索其遗传信息需要更加高效和快速的研究手段和技术。相信随着微生物学、基因组学、化学和检测技术的，环境基因组技术会为药物发现开辟出一条崭新的道路。

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