用积分法考察黄嘌呤对Candida species尿酸酶的抑制作用

【关键词】  尿酸酶

    Characterization of inhibition of xanthine on Candida species uricase by integrated method

　　【Abstract】 AIM: To investigate the prerequisite of the integrated method for characterizing inhibitors with the inhibition of xanthine on Candida species uricase as the model.  METHODS:  Uricase reaction curve was monitored by absorbance at 293 nm. The apparent kinetic parameters (apparent MichaelisMenten constant, Kmapp, and apparent maximal reaction rate, Vmapp) were estimated by nonlinear fitting reaction curve to the integrated MichaelisMenten rate equation with the predictor variable of reaction time. The inhibition type and inhibition constant (Ki) were determined based on the responses of apparent kinetic parameters to xanthine concentrations. RESULTS:  Outliers in reaction curve greatly reduced the reliability of parameters obtained by this integrated method. With residual substrate below onesixth of Kmapp and initial substrate high enough, this integrated method usually showed deviation below 20% for Kmapp and smaller deviation for Vmapp. By this integrated method with the same range of data for analysis, Kmapp was consistent to that by LineweaverBurk plot and the response of Kmapp to xanthine concentrations gave inhibition constant of (5.4±0.8) μmol/L (n=3), also consistent to that by LineweaverBurk plot. CONCLUSION:  This integrated method is feasible for fast screening of special inhibitors with data of higher precision and initial substrate above fourfold of MichaelisMenten constant (Km) in the absence of inhibitor and residual substrate below onesixth of this Km for analysis.

　　【Keywords】 Integrated Method;  LineweaverBurk plot;  uricase;  xanthine;  MichaelisMenten constant;   inhibition constant

　　【摘要】 目的: 以Candida species尿酸酶为模型，考察用积分法筛选抑制剂的条件. 方法: 用293 nm吸收记录尿酸酶反应. 用反应时间为自变量的积分速度方程拟合反应曲线确定表观米氏常数(apparent MichaelisMenten constant, Kmapp)和表观最大反应速度(apparent maximal reaction rate, Vmapp). 据上述参数随抑制剂浓度的变化确定抑制类型和抑制常数(inhibition constant, Ki).  结果: 被分析数据中的畸异值显著降低结果可靠性. 通常终点底物<1/6 Kmapp而起始底物足够高，此积分法测定Kmapp的偏差和变异低于20％而Vmapp精度更高. 用积分法所得Kmapp与双倒数法一致，且和黄嘌呤浓度成正比，对应Ki为(5.4±0.8) μmol/L (n=3)，也与双倒数法一致.  结论: 被分析数据精度足够高，用无抑制剂时米氏常数（MichaelisMenten constant, Km）4倍以上的起始底物浓度并固定终点底物浓度<1/6 Km，此积分法能用于筛选特殊类型的抑制剂.

　　【关键词】 积分法； 双倒数分析法； 尿酸酶； 黄嘌呤； 米氏常数； 抑制常数

　　0引言

　　酶抑制剂是新药开发热点. 通常据表观米氏常数（apparent MichaelisMenten constant, Kmapp）和表观最大反应速度（apparent maximal reaction rate, Vmapp）随抑制剂浓度变化同步确定抑制类型和抑制常数（inhibition constant, Ki）筛选抑制剂［1］. 双倒数法测定Kmapp和Vmapp筛选抑制剂需要底物浓度分布在米氏常数(MichaelisMenten constant, Km)两侧，且范围应尽量宽. 此法测定动力学参数对低浓度底物下初速度误差和底物浓度本身的误差都非常敏感，用于筛选抑制剂的成本也很高. 用积分速度方程酶反应曲线，即积分法，可同步确定Km和最大反应速度(maximal reaction rate, Vm). 经典积分法所用积分速度方程自变量缺乏统计合理性，所得参数可靠性低［2］. 最近发现用以反应时间为自变量的积分速度方程拟合酶反应曲线，能可靠测定酶动力学参数并筛选抑制剂［3-7］. 此积分法筛选抑制剂对初始底物浓度误差不敏感，且效率高而成本低. 我们用此积分法考察黄嘌呤对Candida species尿酸酶的抑制作用，以期进一步明确此法筛选抑制剂的可靠性和应用条件.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　尿酸、黄嘌呤购自ICN, Candida species尿酸酶(E.C 1.7.3.3)购自Sigma ［U 0880］. 其余试剂为国产分析纯.

　　1.2方法

　　缓冲液含100 μmol/L二乙基三氨基五乙酸［6,7］. 反应体系含1.0 mL缓冲液，底物、抑制剂和酶液共0.20 mL. 用双倒数法分析时，酶为0.083 μkat/L，记录反应延迟30 s后反应1 min内的数据. 积分法分析时，酶为0.333 μkat/L，初始底物浓度为55 μmol/L，在(25±0.5)℃以10 s间隔记录启动反应40 s后底物消耗到<1/8 Kmapp(双倒数法测定)的反应曲线. 用线性回归确定双倒数法所得参数. 积分法测定参数按以前方法分析启动反应40 s后光吸收变化>0.001的6个以上数据［7］. 用Visual Basic 6.0编写程序，数据记录成文件读入，作图鉴别畸异值，结果输出到指定文件. 线性回归分析Kmapp及1/Vmapp随抑制剂浓度的变化确定对应的抑制常数. 根据两种抑制常数的统计有效性和相对大小确定抑制类型［8］.

　　统计学处理：   结果用x±s表示，用SAS 8.2分折数据，P<0.05为有统计学差异.

　　2结果

　　双倒数法分析无抑制剂时9～70 μmol/L底物下初速度得Km为（6.2±0.8）μmol/L (n=3). 用积分法分析起点为40 μmol/L而终点接近1.0 μmol/L反应曲线得Km为（6.3±0.8）μmol/L (n=8). 两种方法无差异（P>0.5）. 反应初始阶段畸异值对积分法结果影响很小，但在底物浓度降低到接近Km时即使0.001的光吸收偏差可导致Km的偏差达20％. 升高终点底物浓度常造成Km负偏差，降低起点底物浓度造成正偏差. 如被分析数据中没有明显畸异值，起点底物浓度在双倒数法所得Km的2倍以上，终点底物浓度在1/6 Km以下波动时积分法所得Km变化<15％，而Vm的变化常<10%. 如终点底物浓度>3.0 μmol/L，起始底物>40 μmol/L时所得Km变异和偏差也接近20％. 如起始底物浓度远>Km，则剩余底物浓度

　　黄嘌呤为18 μmol/L时双倒数法所得Kmapp<30 μmol/L. 用黄嘌呤升高Kmapp后积分法对畸异值的敏感性显著降低. 如起始底物浓度>双倒数法所得Kmapp的1.4倍，获得与双倒数法偏差<20％的Kmapp所需剩余底物浓度与黄嘌呤浓度正相关. 固定起始底物浓度为40 μmol/L，在5 μmol/L黄嘌呤时需终点底物浓度<1.5 μmol/L，13 μmol/L黄嘌呤时需终点底物浓度<3.0 μmol/L，18 μmol/L黄嘌呤时需终点底物浓度<4.0 μmol/L，所得Kmapp偏差才可<15％. 分析起始底物浓度接近40 μmol/L而终点底物浓度接近1.0 μmol/L的反应曲线，积分法所得Kmapp与双倒数法一致，且与抑制剂浓度成正比. 据Kmapp的变化，积分法得Ki为（5.4±0.8）μmol/L (n=3)，双倒数法得Ki为（5.0±0.4）μmol /L (n=3)，二者也无差异(Tab 1). 重复测定抑制常数时两种方法所得Vmapp都有一次随黄嘌呤浓度升高而下降，但分析1/Vmapp变化所得Ki都高于分析Kmapp变化所得Ki的17倍.表1表观动力学参数对黄嘌呤浓度（CI）的响应（略）

　　3讨论

　　本结果表明,适当条件下此积分法能可靠测定Kmapp和Vmapp. 测定黄嘌呤抑制下的Candida species尿酸酶动力学参数时，起始底物浓度越高则此积分法所允许的终点剩余底物浓度也越高，但所允许的终点剩余底物浓度都需要<1/6 Kmapp. Candida utilis尿酸酶Km接近12 μmol/L，此积分法在起点>Km时可靠测定其Km也需剩余底物浓度<2 μmol/L［7］. 因此，当起始底物浓度>Kmapp时，终点剩余底物浓度<1/6 Kmapp可能是此积分法测定动力学参数的必要条件. 0.8 μmol/L尿酸的吸收<0.010. 按光吸收随机误差为0.001推算，测定0.8 μmol/L尿酸的误差在10％以上. 以剩余底物浓度<1/6 Kmapp和底物定量下限为0.8 μmol/L为前提，此积分法测定Km下限接近5 μmol/L，与模拟分析结果一致［7］. 用积分法和双倒数法考察黄嘌呤对Candida species尿酸酶的抑制作用时，Vmapp随黄嘌呤浓度增大而偶尔略降低可能源自实验误差，而黄嘌呤对Kmapp非常显著的改变说明其对于Candida species尿酸酶仍然是竞争性抑制剂. 我们所述积分速度方程自变量为反应时间，方程统计合理性高，结果更可靠. 自动记录反应曲线有利于减少畸异值. 分析启动反应40 s后的数据可保障分析稳态反应数据. 调节酶活性使启动反应40 s后底物浓度维持在4倍Km(无抑制剂时)以上，则此积分法允许竞争性抑制剂浓度在其抑制常数的两倍范围内波动. 非竞争性抑制剂不改变酶Km，故用积分法筛选此类抑制剂时可能允许抑制剂浓度在更宽范围内变化且所需底物浓度可能更低. 因此，对于反应曲线可连续记录、产物无抑制作用且反应不可逆的米氏酶，固定终点底物浓度<1/6 Km，可靠记录4倍Km以上起始底物浓度下的反应曲线，通过调整抑制剂浓度使得被分析起点的底物浓度在对应Kmapp的1.4倍以上，用此积分法就有望快速低成本测定表观动力学参数，并筛选其竞争性和非竞争性抑制剂.

　　【】

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