Avermectin B1a组分高产菌株的诱变育种

                作者：任超 马王向坡 李宝库 路新利

【关键词】  Avermectin,B1a组分；,诱变；,效价；,高产菌株

　   摘要： 目的 了解avermectin产生菌S.avermitilis的生长特性，提高产生菌B1a组分的产量。方法 采用紫外线、诱变剂亚硝基胍并结合甲硫氨酸诱变等手段对出发菌株S.avermitilis N56进行诱变处理，初筛、复筛。结果 筛选获得总效价达到45258μg/ml的高产除虫链霉菌突变株A3，B1a比例提高到560%。结论 采用紫外线及亚硝基胍诱变方法，结合甲硫氨酸诱变筛选，与出发菌株相比可以获得avermectin总效价及B1a组分显著提高的菌株。

　关键词： Avermectin B1a组分； 诱变； 效价； 高产菌株

        ABSTRACT Objective To study the characteristics of avermectin producing strains and improve avermectin B1ayield of Streptomyces avermitilis. Method UV and NTG were used as mutagens to treat the original strain N56 as well as methionine as inducer. Results The highyield avermectin strain A3 with avermectin total titer up to 45258 μg/ml was obtained, the ratio of avermectin B1awas increased to 560%. Conclusion It is an effective method of screening highyield avermectin B1athrough mutation by UV and NTG and induction with methionine.

　KEY WORDS Avermectin B1a; Mutagenesis; Titer; Highavermectinproducing strain

    Avermectin的产生菌是除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)，该菌株是1975年日本北里研究所(Kitasato Institute)从日本静岗县地区的一个土壤样品中分离得到的。研究初期已发现该菌株的发酵液具有很高的驱肠道寄生虫活性，该菌株后被送到美国Merck公司作进一步研究。1976年，美国Merck公司的科研人员分离了这组具有驱虫活性的物质，并将其命名为avermectins［1］。Avermectins是一类结构相似的十六元大环内酯类抗生素，共有8个组分，分别命名为A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a和B2b。其中A1a、A2a、B1a和B2a为4个大量组分，含量在80%以上；A1b、A2b、B1b和B2b为4个小量组分，含量在20%以下，结构见图1。B1的杀虫活性最高，毒性最小。近年，众多科研工作者通过诱变等手段改造菌种的遗传特性，提高avermectin有效组分B1比例，大村智等在这方面做了很多贡献［2］。Avermectin B1a(大于80%)和B1b(小于20%)混合物阿巴菌素(abamectin)已用于畜牧抗虫和农业上的杀螨及选择性的杀虫剂。Avermectins R1 XY R2A1a CH3 CH=CH C2H5A1b CH3 CH=CH CH3A2a CH3 CH2-CH(OH) C2H5A2b CH3 CH2-CH(OH) CH3B1a H CH=CH C2H5B1b H CH=CH CH3B2a H CH2-CH(OH) C2H5B2b H CH2-CH(OH) CH3图1 Avermectins结构图

    1 材料和仪器

    1.1 菌种除虫链霉菌S.avermitilis N56由河北大学微生物研究所提供；突变株A3由甲硫氨酸平板筛选获得。

    1.2 试剂生理盐水，亚硝基胍(NTG)，磷酸盐缓冲液(pH60)，甲硫氨酸(Met)，丙酮(分析纯)，乙酸乙酯(分析纯)，无水甲醇(色谱纯及分析纯)，GF254硅胶粉，三氯甲烷(分析纯)，二氯甲烷(分析纯)。

    1.3 培养基斜面和分离培养基(g/L) 可溶性淀粉10，(NH4)2SO4 25，NaCl 06，MgSO4・7H2O 12，K2HPO4・3H2O 30，CaCO3 30，琼脂粉20，pH72～74，用蒸馏水配制。种子培养基(g/L) 玉米淀粉25，花生饼粉10，黄豆饼粉80，酵母粉50，酵母膏50，玉米浆40，CoCl2・6H2O 0003，淀粉酶00025，pH70～72，用自来水配制。发酵培养基(g/L) 玉米淀粉70，花生饼粉10，黄豆饼粉80，酵母粉50，酵母膏30，玉米浆22，CoCl2・6H2O 0003，淀粉酶00025，pH70～72，用自来水配制。

　1.4 诱变及筛选方法

    1.4.1 紫外线诱变 取制备好的菌悬液5ml移入直径为90mm的无菌培养皿中，放入无菌磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上，功率20W，波长254nm紫外灯下30cm处打开皿盖边搅拌边照射，剂量分别为15、30、45、60和75s，可以累积照射，也可分别照射不同时间。取不同照射时间段的菌悬液1ml，进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7梯度稀释，取10-3、10-5、和10-7浓度的稀释液各01ml涂布于分离平板上，用黑纸包严，28℃倒置培养7～9d。

    1.4.2 亚硝基胍(NTG)诱变 用01mol/L，pH60的磷酸盐缓冲液制备孢子悬液，使浓度为108个/ml，分别用1、2、3和4mg/ml浓度的NTG处理紫外诱变后的突变株单孢子悬液，于28℃震荡30min，用生理盐水离心洗涤孢子3次，经稀释后涂布于分离平板28℃倒置培养7～9d。

    1.4.3 甲硫氨酸(Met)诱变 将不含甲硫氨酸的斜面培养基20ml倒入培养皿中，待凝固后倒入10ml含有不同浓度的Met斜面培养基，终浓度分别为025、050、10mg/ml。处理后的孢子悬液稀释后涂布于平板上，28℃倒置培养7～9d［3］，挑取优势单菌落转接于斜面，28℃温箱培养。

    1.5 摇瓶发酵从平板上挑取灰色丰满的单菌落转接于斜面，28℃培养7～9d，将长出丰富的灰色孢子转接于种子培养液，220r/min，28℃摇床培养28～30h，接种5%于发酵培养液(250ml三角瓶，装50ml发酵液)，220r/min，28℃摇床培养7～9d，放瓶测定效价。

    1.6 效价测定菌丝溶媒萃取 取发酵液5ml，3000r/min，离心10min，弃上清。加入丙酮2ml，在旋涡式混合器上振荡1min，静置10min，重复3次。加入乙酸乙酯3ml，振荡1min，3000r/min，离心10min，上清液备用。层析法分离纯化 吸取40μl上清液点样于GF254硅胶板上，然后层析。展层剂为：乙酸乙酯∶三氯甲烷∶二氯甲烷∶无水甲醇=9∶9∶2∶1。层析后在紫外灯下观察，将斑点处硅胶刮入离心管中，加入2ml无水甲醇，在旋涡式混合器上振荡1min，静置10min后3000r/min，离心10min。HPLC法测定效价 采用C18反相柱，流动相为无水甲醇∶水(85∶15)，流速1ml/min，检测波长2446nm。准确吸取200μl样品滤液进样，根据各组分的峰面积，对照标准曲线其含量，各组分之和即为总发酵效价。

    2 结果

    2.1 紫外线诱变经紫外线诱变、培养后，活菌计数，计算诱变后的正突变率及孢子致死率，结果如表1。实验中观察到该菌株对紫外线异常敏感，紫外照射时间超过60s，孢子致死率几乎达到100%。所以紫外线照射时间应严格控制在60s以内，这有别于其它的一般链霉菌。随机挑取一定数量菌株经UV诱变的灰色菌落发酵培养后测定avermectin的产量，发现其产抗能力较出发菌落均有明显提高。再从中挑选24个产抗能力强的菌落在平板上反复传代，进一步发酵筛选，获得一菌落特性和产量都较为稳定的突变株A1，发酵效价达24657μg/ml，B1a的比例为371%，较出发菌株有明显提高。将此突变株进行下一步诱变处理。表1 除虫链霉菌N56的紫外线诱变效果 照射时间

    2.2 NTG诱变及筛选随机挑取经NTG诱变后的单菌落转接于斜面，进行筛选，实验结果如表2。由表2可知，在pH 60条件下，NTG的作用浓度为1mg/ml时诱变效果最佳。与出发菌株相比，正突变率达到161%，大于其它处理条件，负突变率最低为448%。但随着NTG浓度的增大，孢子的死亡率逐渐增加，产量正突变率逐渐降低，负突变率逐渐增加。当NTG浓度达到3mg/ml以上时，正突变率为零，负突变率85%～89%。因此用低浓度的NTG作为诱变剂进行菌种选育。经分离、筛选获得突变株A2。

    2.3 Met平板筛选已研究证实Met可促进S腺苷甲硫氨酸(SAM) 表2 NTG的诱变结果NTG浓度因此筛选降解甲硫氨酸能力强的菌株，使甲硫氨酸尽可能地流向能量代谢［4］，以减少SAM合成前体的供给，使菌体内SAM含量相对降低，获得B组分含量较高的菌株。向培养基中加入低浓度的Met，诱变菌体降解甲硫氨酸的能力。向培养基中加入低浓度的甲硫氨酸，在pH60，1mg/ml NTG，28℃水浴处理30min的诱变条件下，诱变效果见图2。由图2可知，加入Met后菌株A2的孢子致死率显著上升，avermectin正突变率比单纯NTG诱变有所下降，负突变率增加，但B1a组分比例正突变率显著上升。加入025mg/ml的Met，B1a组分比例增加的菌株达到149%。随着Met浓度的升高，菌落生长明显受到抑制，孢子明显减少，B1a组分比例正突变率有所下降。实验分离、筛选获得突变菌株A3。

    2.4 摇瓶效价分析由表3可看出，诱变处理出发菌株，获得的突变株A3的总效价及B1a百分比例均显著提高，前者效价达到45258μg/ml，后者组分提高560%，明显高于出发菌株N56。

    2.5 突变菌株的遗传稳定性考察将诱变获得的突变菌株A3通过斜面传代，得到各代子斜面菌株后进行摇瓶发酵，测定各代菌株产量及B1a组分含量的稳定性，F1～F5代的发酵总效价及avermectin中B1a组分比例见表4 表3 出发菌株和突变菌株的摇瓶效价测试比较由表4可见，突变株经A3多次传代，avermectin总效价虽有所下降，但其B1a组分比例基本上比较稳定。证实本实验中所用的诱变筛选方法可有效筛选出avermectin B1a高产菌株。

    3 讨论

　(1)avermectin产生菌的菌落特征很不稳定，存在严重的分化现象，在不同菌落形态的分化菌株中，产灰色孢子的菌株能产生avermectin，但即使经单孢子选出的灰色菌落经传代后，仍分化出不产avermectin的白色和光秃菌落，因此诱变处理后应从分离培养基上挑取产抗能力强的灰色孢子进行发酵培养，以平衡经常出现的发酵效价不稳定现象。(2)菌体内S腺苷甲硫氨酸(SAM)浓度起到调控avermectins的C5位甲氧基化程度作用。当菌体内SAM含量升高时，可以增加avermectin A组分的比例，而减少菌体内SAM的含量可以使B组分的比例升高，B1a组分的比例也随之得以提高。所以，为了增加其有效次级代谢产物B1a组分的比例，在分离平板中加入低浓度的Met，诱变筛选出降解甲硫氨酸能力强的菌株，减少了产物中avermectin A组分的生物合成，提高了有效组分B1a的比例。

    ［1］ 宋渊，曹贵明，陈芝，等. 阿维菌素高产菌株的选育及阿维菌素B1鉴定［J］. 生物工程学报，2000，16(1)：31

    ［2］ Ikeda H, Omura S. Avermectin biosynthesis ［J］. Chem Rev,1997,97(7):2951

    ［3］ Ikeda H, Wang L R, Ohta T, et al. Cloning of the gene encoding avermectin B 5Omethyltransferase in avermectinproducing Streptomyces avermitisis ［J］. Gene,1998,206(2):175

    ［4］ 来彩霞，陈伟，刘党生，等. L异亮氨酸产生菌的定向育种［J］. 沈阳药科大学学报，1998，15(1)：47