基质金属蛋白酶在心肌肥厚大鼠细胞外基质重塑中的作用及氯沙坦干预

         作者：白江涛 陆凤翔 许迪 陈莉 周蕾 雍永宏

【关键词】  心肌肥厚

　　Role of metalloproteinases in rat cardiac extracellular matrix remodeling and effects of losartan on it

　　【Abstract】 AIM: To investigate the role of metalloproteinase (MMP9), tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP1) and transforming growth factorβ1 (TGFβ1) in cardiac hypertrophy and extracellular matrix remodeling and the effects of Losartan on it in a rat model. METHODS:  Male SD rats were randomly divided into three groups: control group, norepinephrine group (1.06 mg・kg-1・d-1×15 d) and  norepinephrine + Losartan group (10 mg・kg-1・d-1×15 d). The rat cardiac hypertrophy models were established by intraperitoneal injection of norepinephrine (NE) twice a day for 15 days. Cardiac hypertrophy and extracellular matrix remodeling were evaluated by echocardiography and morphological examination. The mRNA and protein expression of matrix  metalloproteinase (MMP9), tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP1) and transforming growth factorβ1 (TGFβ1) was examined by reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR) and immunohistochemical analysis. RESULTS:  NEinduced hypertrophy and extracellular matrix remodeling predominantly occurred in the left ventricular and the mRNA and protein expression of the MMP9, TIMP1 and TGFβ1 elevated (P<0.01). After Losartan treatment, the interventricular septal thickness, total collagen, type I, type III collagen and the expression of MMP9 and TGFβ1 decreased (P<0.01). CONCLUSION: MMP9, TIMP1 and TGFβ1 are involved in the cardiac extracellular matrix remodeling induced by NE. Losartan can prevent the cardiac hypertrophy and extracellular matrix remodeling, which is associated with the attenuation of myocardial MMP9 and TGFβ1.

　　【Keywords】 cardiac hypertrophy; extracellular matrix; metalloproteinase; Losartan

　　【摘要】 目的： 探讨基质金属蛋白酶(MMP9)及其生理性抑制剂TIMP1和转化生长因子β1（TGFβ1）在心肌肥厚大鼠细胞外基质重塑中的作用及氯沙坦干预的效果. 方法： 雄性SD大鼠随机分为3组：①对照组;②去甲肾上腺素(norepinephrine, NE)组（1.06 mg・kg-1・d-1×15 d）;③NE+氯沙坦组（10 mg・kg-1・d-1×15 d）. NE腹腔注射，2次・d-1，连续15 d，建立心肌肥厚的模型. 应用超声心动图及病方法评价整体心肌肥厚和组织胶原的表达. 用逆转录聚合酶链反应法（RTPCR）及免疫组化方法检测MMP9, TIMP1和TGFβ1 mRNA和蛋白表达情况. 结果：大鼠腹腔注射NE后发生左心室肥厚及纤维化，胶原的含量及MMP9, TIMP1和TGFβ1的蛋白、mRNA的表达显著高于健康对照组（P<0.01）. 氯沙坦能降低室间隔的厚度，减少左室心肌中总体胶原、I型、III型胶原的合成及MMP9,TGFβ1的表达（P<0.01）. 结论： MMP9, TIMP1和TGFβ1与NE诱导的心肌细胞外基质重塑有关. 氯沙坦能有效的防治心肌肥厚及细胞外基质重塑,这一效应与其降低心肌中高表达的MMP9和TGFβ1有关.

　　【关键词】 心肌肥厚；细胞外基质；基质金属蛋白酶；氯沙坦

　　0引言

　　基质金属蛋白酶（metalloproteinases, MMPs）是一类包含锌离子的内源性蛋白水解酶，是细胞外基质（ECM）的主要生理调节因子. 最近研究发现，MMPs在心梗后心衰的发病机制中具有重要的作用［1］. 转化生长因子β１（TGFβ1）被证实能促进组织纤维化和ECM积聚［２，３］. 有关延缓或防止心肌重塑的及其相关机制的研究，一直是心血管领域的热点. 我们旨在探讨MMP9及其生理性抑制剂TIMP1和TGFβ1在大鼠心肌肥厚及细胞外基质重塑过程中的作用及氯沙坦的防治作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料动物模型及分组： 雄性SD大鼠25只（南京医科大学动物实验中心），体质量250~280 g，随机分为3组: ①对照组（n=8）；②去甲肾上腺素组(norepinephrine, NE) (n=8)；③NE+氯沙坦（默沙东公司）(n=9). NE注射液1.06 mg・kg-1・d-1, 腹腔注射,2次・d-1，连续给药15 d，制备心肌肥厚模型，对照组腹腔注射生理盐水及蒸馏水灌胃. 氯沙坦10 mg・kg-1・d-1早晨1次灌胃给药，疗程15 d.

　　1.2方法

　　1.2.1超声心动图检查3组动物在实验前及后15 d进行超声心动图检查，方法如下：大鼠麻醉后固定，连接心电图，应用美国HP Sonos5500型彩色超声诊断仪，探头频率8.0~12.0 MHz，取胸骨旁左室短轴切面，在二尖瓣腱索水平记录M型超声运动曲线后，分别测量舒张末期室间隔厚度(IVST)、左室后壁厚度(LVPWT)、左室舒张末期内径(LVEDd)和左室收缩末期内径(LVESd)，短轴缩短率（FS）和射血分数(EF). 应用脉冲波多普勒超声测量舒张早期(E峰)和舒张晚期(A峰)的最大流速并计算E／A比值. 各指标均在连续3个心动周期上测量后取其平均值.

　　1.2.2病理检查①左心室质量和体质量的测定：动物称质量后处死，取出心脏，分离左、右心室，用天平称取左心室质量(LVM)，计算左心室质量与体质量比(LVM/BW)表示左心室肥厚的程度.  ②心肌胶原形态学的观察及定量分析：部分左室心肌组织，40 g・L-1甲醛液固定，石蜡包埋，4 μm切片. VanGieson(VG)染色法使胶原特殊染色，光镜检查，心肌细胞呈黄色，胶原呈红色，并用全自动图像分析仪行图像处理. 每个标本选一个切片，测量左心室心肌的胶原容积分数(CVF)(左心室胶原面积/所测视野面积). 随机取4个视野，以均值作为该心脏的CVF.

　　1.2.3免疫组化方法测定心肌Ⅰ型和Ⅲ型胶原、MMP9, TIMP1, TGFβ1蛋白表达石蜡切片常规脱蜡至水，3 mL・L-1过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，热修复抗原后，100 mL・L-1正常山羊血清封闭非特异性抗原. 滴加一抗（1∶100稀释）（购自武汉博士德生物公司），4℃过夜. 滴加生物素标记的二抗；37℃孵育30 min；滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液；DAB显色，封片. 以TBS代替一抗作阴性对照. 应用多功能彩色图像分析系统对I型和III型胶原（心肌细胞间隙及血管周围棕色条纹）、MMP9, TIMP1, TGFβ1蛋白（细胞质中棕褐色颗粒为阳性）表达进行图像分析，表达强度用平均灰度值表示.

　　1.2.4逆转录聚合酶链反应法（RTPCR）方法检测MMP9, TIMP1和TGFβ1 mRNA表达① MMP9 cDNA引物: 上游序列5′CCCTGCGTATTTCCATTCATC3′下游序列5′ACCCCACTTCTTGTCAGCGTC3′，二引物之间扩增片段含300个核苷酸; TIMP1: 上游序列5′CCCAACCCACCCACAGACAGC3′, 下游序列5′AACGGCCCGCGATGAGAAACT3′二引物之间扩增片段含254个核苷酸;TGFβ1: 上游序列5′ CTGGTTGGGAGAAGAGGAAA 3′, 下游序列5′GGGAGAAAGCAGCAGGAGTC3′, 二引物之间扩增片段含471个核苷酸;βactin: 上游序列5′CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC3′, 下游序列5′TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT3′二引物之间扩增片段含240个核苷酸（上海生工公司合成以上反应引物）.    ②逆转录反应：Eppendorf管中依次加入用TRIzol(美国Gibco公司)提取的总RNA 2 μg,10倍稀释的Oligo dT15 2 μL, 70℃ 5 min；再加入10 mmol・L-1 dNTP 1 μL,RNAase抑制剂0.5 μL,MMLV逆转录酶１ μL(美国Promega),5×MMLV缓冲液2 μL, DEPC水1.5 μL, 42℃ 60 min, 95℃ 5 min终止反应. 合成的cDNA 4℃保存. ③聚合酶链反应：Eppendorf管中依次加入cDNA 1 μL,10×PCR缓冲液2 μL,上下游引物各0.5 μL, MgCl2 0.3 μL,Taq DNA聚合酶0.3 μL,10 mmol・L-1 dNTP 0.3 μL,双蒸水14.2 μL. 95℃变性30 s,退火30 s，72℃延伸1 min, MMP9的退火温度为59℃,最适循环数为28个循环；TIMP1的退火温度为60℃,最适循环数为32个循环；TGFβ1的退火温度为55℃,最适循环数为30个循环. 72℃延伸7 min. 取上述PCR产物5 μL，20 g・L-1琼脂糖凝胶电泳分离后，扫描仪扫胶,储存于电脑中进行扫描分析，计算目的基因RTPCR产物吸光度×阳性信号面积与βactin产物吸光度×阳性信号面积之比值，作为目的基因mRNA的相对含量.

　　统计学处理： 应用SPSS 10.0软件包对数据进行统计分析. 各指标用x±s表示. 组间比较在方差齐时用方差分析，方差不齐时用非参数秩和检验，P<0.05为有显著性差异.

　　2结果

　　2.1超声心动图检查在NE组，室间隔厚度(IVST) (1.71±0.13)与对照组(1.25±0.11)比较明显增大（P<0.01），而左室舒张末内径(LVEDd) (6.1±0.12)和左室收缩末内径(LVESd) (2.82±0.12)与对照组相比(LVEDd: 6.30±0.11; EVESd: 2.98±0.21)没有扩大，反映心功能的短轴缩短率（FS） (36.5±4.7)和射血分数(EF) (71.2±4.1)正常，表明心肌肥厚的模型成功建立而没有心衰的发生,且E峰降低，A峰增高，与对照组(1.32±0.22)比较E／A比值(0.80±0.13)降低（P<0.01），表明肥厚心肌舒张功能减退. 相对于NE组(1.71±0.13),氯沙坦组IVST降低(1.32±0.10)，而E／A比值(1.19±0.10)比NE组(0.80±0.13)增高（P<0.01）.

　　2.2病理检查NE组，左室质量指数（3.12±0.14）显著高于对照组（2.01±0.12，P<0.01）. 在氯沙坦+NE组，左室质量指数（2. 28±0.10）较NE组降低（P<0.01）. 镜下观察，与对照组相比，NE组心肌细胞肥大，心肌内小血管周围及心肌间质有较多胶原沉积，左室心肌总体胶原容积分数(CVF)明显增高（P<0.01）. 在氯沙坦+NE给药组，心肌胶原沉积减少，CVF降低（P<0.01）.

　　2.3心肌I型和III型胶原、MMP9, TIMP1, TGFβ1蛋白表达NE组心肌I型和III型胶原蛋白表达较对照组增高（P<0.01）在小血管周围及心肌间质均增加，氯沙坦+NE组，这两型胶原均降低(P<0.01)， NE组心肌MMP9, TIMP1, TGFβ1蛋白表达显著增高（P<0.01），氯沙坦+NE组与NE组对比，MMP9和TGFβ1表达降低，TIMP1没有明显改变（P>0.05，Tab 1，Fig 1）.

　　表1MMP9, TIMP1和TGFβ1 蛋白在左室心肌的表达　(略)

　　2.4心肌MMP9, TIMP1, TGFβ1 mRNA水平NE组MMP9, TIMP1, TGFβ1 mRNA含量较对照组增高（P<0.01）；氯沙坦+NE组与NE组对比,MMP9和TGFβ1 mRNA水平降低(P<0.01), TIMP1 mRNA没有明显改变（P>0.05，Tab 2, Fig 2）. 以上各指标mRNA与蛋白表达水平平行.

　　3讨论

　　目前已知在心肌肥厚的过程中，心肌中交感神经系统激活，其末梢释放儿茶酚胺增多. 本实验应用腹腔注射NE建立大鼠心肌肥厚模型，超声心动图测量的室间隔厚度（IVST）较对照组明显增加，脉冲波多普勒超声测量舒张早期的E峰降低，舒张晚期

　　图1氯沙坦对大鼠左室心肌中I型胶原及TGFβ1表达影响　(略)

　　表2MMP9, TIMP1和TGFβ1 mRNA在左室心肌的表达　(略)

　　图2MMP9,TIMP1,TGFβ1 mRNA的电泳结果　(略)

　　峰增高，E／A比值降低，病检查左室质量指数（LVW/BW）增高，表明心肌肥厚的动物模型成功建立，且肥厚主要发生在左心室并有舒张功能减退.

　　本实验结果显示NE组心肌总体胶原及Ⅰ型、Ⅲ型胶原明显增多，表明发生了心肌纤维化，是引起舒张功能减退的主要原因. 氯沙坦组，总体胶原及Ⅰ型、Ⅲ型胶原显著降低，且超声心动图及显微镜下观察均显示，NE诱导的心肌肥厚及纤维化能被氯沙坦抑制. 这些结果表明氯沙坦能够有效地预防心肌肥厚及细胞外基质的重塑，改善舒张功能. 因为Ⅰ型、Ⅲ型胶原的机械特性不同，其合理比例对于维持正常的心肌结构非常重要［４，５］. 本实验中，不论是NE组还是氯沙坦给药组，Ⅲ型／Ⅰ型胶原的比例均无异常改变.

　　基质金属蛋白酶（MMPs）存在于正常心肌中且能降解所有细胞外基质成分，是心肌细胞外基质重塑的始动因子. 随着对MMPs研究的增多，其家族成员也在迅速扩大. 根据MMPs底物特异性和结构差异分为四大类，其中，明胶酶（MMP2,MMP9）因其降解明胶及其他特性而倍受关注. 最近研究发现，明胶酶还能有效分解间质胶原［６，７］，因为其能启动纤维性胶原的降解过程，目前认为明胶酶在细胞外基质重塑过程中具有十分重要的作用［８］. 本实验中，在NE组心肌MMP9蛋白及mRNA表达均增高，而氯沙坦能显著降低MMP9的高表达. TIMPs是内源性MMPs抑制剂，目前发现有四种（TIMP14），TIMP1能抑制大多数MMPs的活性. 在本实验NE组，TIMP1表达增高，且蛋白和mRNA表达平行. 目前有关引起TIMP上调的因素还不清楚. 有研究发现一些细胞因子和生长因子能够调节TIMP1的表达［９］. 其中，转化生长因子β能够上调MMP2，MMP9和TIMPs的表达［10］. 本实验中，增高的TGFβ1可能与TIMP1表达上调有关，但氯沙坦并不影响TIMP1的表达. 目前已知转化生长因子β1（TGFβ1）能够促进组织的修复和纤维化. 是细胞外基质成份产生的强有力的始动因子. 本研究结果显示 ，NE组TGFβ1蛋白及mRNA表达增高，氯沙坦能够降低左室组织中TGFβ1的高表达，表明 AT1受体与 NE诱导的心肌重塑有关，但其确切机制还不清楚. 许多研究发现在血管紧张素与TGFβ1之间存在着交联［11,12］. 氯沙坦减少胶原产生的机制之一可能是降低了AT1受体对TGFβ1的刺激作用［13］.

　　【】

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