白藜芦醇诱导肿瘤细胞凋亡和细胞周期阻滞的作用及机制

【关键词】  白藜芦醇

     Resveratrol induced apoptosis and cell arrest in cancer cells

　　【Abstract】 AIM: To study the mechanism of resveratrol induced HepG2 and K562 cells apoptosis and cell arrest. METHODS:  Cell morphological method and Annexin V technology were used to detect HepG2 and K562 cells apoptosis, flow cytometry (FCM) was used to detect the cell cycle and MTT was used to detect the medicine sensitivity of HepG2 and K562 cells. RESULTS:  Apoptosis was seen in human liver cancer HepG2 cell treated with resveratrol and nuclear chromatine condensation and fragmentation were observed in HepG2 cells. Typical ladder patterns of DNA fragmentation were also observed. The highest rate of HepG2 cell apoptosis was 33.7% by Annexin V. Cell cycle stopped at S phase and cell apoptosis rate was 9.97% by FCM. Time and dose dependent effects of resveratrol to HepG2 cell were detected by MTT. Resveratrol had no effect on K562 cells. CONCLUSION:  Resveratrol induces HepG2 cell apoptosis and inhibits the development of human liver cancer with a time and dose dependent effect. The resveratrolinduced cell apoptosis is specific to cancer cells.

　　【Keywords】 resveratrol; apoptosis; cell cycle; hepG2; K562

　　【摘要】 目的: 探讨白藜芦醇(RES)诱导人肝癌HepG2、人慢粒K562肿瘤细胞凋亡和细胞周期阻滞的作用及机制. 方法: 应用形态学方法,Annexin V荧光染色检测HepG2，K562细胞凋亡的发生,应用流式细胞术(FCM)检测细胞周期，应用四唑蓝比色法(MTT)检测HepG2，K562肿瘤细胞对,RES的药物敏感性. 结果: RES对人肝癌HepG2细胞的生长有明显的抑制作用,并诱导肿瘤细胞发生凋亡. 凋亡细胞表现为细胞固缩, 核染色质碎裂.  Annexin V荧光染色检测HepG2细胞凋亡率为33.7%,用FCM检测细胞周期明显阻止于G1期，而K562细胞凋亡率为9.97%.  MTT检测表明RES对人肝癌HepG2细胞有剂量效应关系. 但RES对人K562细胞的生长无明显的抑制作用. 结论：RES通过诱导HepG2细胞凋亡抑制肿瘤的生长，并有剂量效应关系.  同时RES对肿瘤细胞的抑制及诱导凋亡的作用有细胞选择性.

　　【关键词】 白藜芦醇；细胞凋亡；细胞周期；HepG2；K562
　
　　0引言

　　白藜芦醇（Resveratrol，RES）是一种重要的活性化合物，广泛存在于植物中. 具有顺式及反式两种结构,反式具有生物学活性. 其化学名为反3，4′，5三羟基芪，它所具有的对心血管疾病和肿瘤的预防和保健作用已在国际上引起广泛的关注及深入研究.  RES有广泛抗癌和防癌作用，在致癌作用的3个主要阶段均［1］具有化学防癌活性. 因此，我们以RES分别诱导人肝癌HepG2和慢粒K562肿瘤细胞凋亡的影响及作用来探讨RES诱导肿瘤细胞凋亡和细胞周期阻滞的机制.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　人肝癌HepG2和慢粒K562细胞由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室第四实验室冻存.  RES购于Sigma公司,溶于二甲基亚砜（DMSO, 购于Sigma公司）,浓度稀释为5×106 mol/L,-20℃备用.  RPMI 1640和新生牛血清购自Invitrogen公司.  MTT购于华美生物工程公司，溶于1×PBS（10 mmol/L, pH 7.4）使浓度为5 g/L，0.22 μm的微孔过滤除菌后4℃备用. DNA荧光染料(PI和Annexin V)购于Coulter公司，4℃备用.

　　1.2方法

　　1.2.1细胞培养人肝癌1×105 HepG2和慢粒K562细胞培养于含100 mL/L新生牛血清的RPMI 1640培养液中，加入1×105 ｕ/L青霉素,100 mg/L链霉素,置于孵箱，在37℃,50 mL/L CO2饱和湿度的条件下培养，实验时取对数生长期细胞.

　　1.2.2形态学观察以5,10,20,50和100 μmol/L RES作用细胞，24~72 h后免疫相差倒置显微镜下观察HepG2和K562细胞形态变化情况.

　　1.2.3Annexin V荧光染色检测细胞凋亡收集1×106细胞(HepG2细胞在收集前已用Annexin V 5 μL 37℃孵育10 min), PBS洗2遍，800～1000 r/min离心5 min，弃上清，加入预冷的结合缓冲液重悬细胞，加入5 μL PI和5 μL Annexin V于细胞悬液中（每份样品均设立凋亡细胞阴性对照和阳性对照,以调整样品检测的最佳工作电压和双色荧光补偿）, 轻轻混匀后4℃避光染色10 min，流式细胞术（FCM)分析.

　　1.2.4FCM检测细胞周期收集1×106细胞, PBS洗2遍，800~1000 r/min离心5 min，弃上清，加入1 mL生理盐水制成单细胞悬液. 加入预冷的无水乙醇2 mL快速混匀，固定细胞. 弃固定液，PBS洗2遍，1000 r/min离心5 min，加入1 mL DNA荧光染料PI，4℃避光染色15 min，FCM分析.

　　1.2.5四唑蓝比色法（MTT）检测RES对细胞生长的影响收集细胞，将细胞重新接种至96孔板中，使其每孔细胞数为1×103~1×104个，分别以20,50和100 μmol/L RES作用细胞，加入100 mL/L新生牛血清的RPMI 1640培养液培养. 于加药后24, 48和72 h进行检测. 每孔加入MTT溶液20 μL, 37℃继续培养4 h后弃上清，每孔加入150 μL DMSO溶解样品,用酶联免疫检测仪测定各孔490 nm吸光度值，均值，绘制生长曲线.