GluR1在大鼠海马结构的表达

          作者：蒋马莉，韩太真, 杨东伟

【关键词】  海马

　　Expression of GluR1 in the hippocampus  of rats

　　【Abstract】 AIM:  To  investigate the expression of AMPA receptor subunit GluR1 in the hippocampus of rats. METHODS: The expression and distribution of GluR1 in hippocampus of rats were examined by using SP immunohistochemical staining method. RESULTS: There was a widespread expression of GluR1 in the hippocampus of adult rats, especially in stratum pyramidal cell, stratum orient and stratum lucidum of CA3 region, and  interneuron of dentate gyrus. Positive expression was  mainly located  in the cytomembrane and processes of the neurons in the CA1 area,  and also in the cytoplasm in the CA3 area.  CONCLUSION:  The expression of GluR1 in the hippocampal CA1 and CA3 area is different. This difference may be attributed to the different functions in different hippocampal subregions.

　　【Keywords】 receptors, AMPA; GluR1;  hippocampus; immunohistochemistry

　　【摘要】 目的： 观察AMPA受体亚单位GluR1在大鼠海马的表达.   方法：  在多聚甲醛固定的海马切片上，用免疫组化SP法观察GluR1在正常成年大鼠海马结构的表达与分布. 结果：  GluR1在正常大鼠海马有广泛表达，在CA3区的起层、锥体细胞层和透明层及齿状回门区内的中间神经元表达最强. 阳性表达在CA1区主要见于神经元的胞膜和突起，而在CA3区还可见于胞质. 结论：  GluR1在海马CA1区和CA3区的表达不同，这种差异可能与海马不同区域具有不同功能有关.
 
　　【关键词】 受体, AMPA； GluR1；海马；免疫组织化学

　　0引言

　　αamino3hydroxyl5methyl4isoxazole propionic acid (AMPA)受体在中枢神经系统介导大多数快速兴奋性突触传递，在长时程增强（LTP）、长时程抑制（LTD）和学习记忆等方面均具有重要作用［1］. GluR1是海马神经元AMPA受体的重要组成部分, 它对于突触可塑性及空间记忆的保留是必需的［2］. 但是GluR1究竟在海马不同区域的分布特征如何，仍不清楚. 我们观察了GluR1在海马的分布，以探讨其分布与功能之间的联系.

　　1材料和方法

　　1.1材料SD雌性大鼠6只，体质量220~260 g（由西安大学医学院实验动物中心提供），用颗粒型大鼠饲料喂养，自由饮水，动物房温度维持于(21±1)℃，光暗周期为12 h∶12 h,交替时间为7∶00 am. AMPA受体亚单位GluR1抗体购自Sigma公司，SP组化试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中山生物公司.

　　1.2方法动物用20 g・L-1戊巴比妥钠按45 mg・kg-1腹腔注射麻醉后打开胸腔，经心脏快速灌注生理盐水100 mL, 再用40 g・L-1多聚甲醛 (PB配制, PH 7.4) 300 mL 灌注固定. 取全脑，修块，浸入40 g・L-1多聚甲醛中后固定，4℃过夜. 用振荡切片机作冠状连续切片，片厚40 μm. 切片隔3张取1张，共4片，做漂浮染色. 反应步骤为：① 0.1 mol・L-1 PBS漂洗, 3×5 min； ② 3 mL・L-1 H2O2处理30 min，封闭内源性过氧化物酶,然后用0.1 mol・L-1 PBS漂洗, 3×5 min；③ 10 g・L-1  Triton室温孵育1 h; 0.1 mol・L-1 PBS漂洗, 3×5 min；④ 正常羊血清封闭，室温1 h；⑤ 兔抗GluR1抗体，4℃，72 h； 0.1 mol・L-1 PBS漂洗, 5×5 min；⑥ 生物素化羊抗兔抗体室温1 h；0.1 mol・L-1 PBS漂洗, 5×5 min；⑦ SP复合物室温1 h; 0.1 mol・L-1 PBS漂洗, 5×5 min；⑧ DAB显色；⑨ 裱片，常规脱水, 透明, 中性树胶封片. 阴性对照用正常羊血清替代一抗孵育，其他步骤相同. 实验动物采用同一流程，外部条件保持基本一致. 结果判断以细胞结构呈明确的棕黄色为阳性染色. 所有阴性对照切片不着色,或仅呈淡的背景色.

　　2结果

　　大鼠脑切片上，肉眼可见两侧海马结构较其他部分染色显著增强. 光镜下GluR1在海马结构染色明显强于其他脑区,并且在海马结构的各区广泛表达，以CA3区的多形层、锥体层和透明层及齿状回门区内的中间神经元着色最深，呈棕黄色. 在CA1区，胞体呈圆形, 阳性结构主要分布在胞膜和突起(Fig 1A); 在CA3区，胞体呈椭圆或圆形, 突起长, 染色强, 阳性表达在突起、胞膜及近胞膜处的胞质均有不均匀分布，而胞核及核周的胞质未见着色(Fig 1B). 齿状回颗粒细胞排列紧密，细胞较小，阳性表达主要在胞膜和突起，而在门区的中间神经元，细胞少，胞体大，突起多，阳性表达在胞膜、胞质及突起均可见.

　　图1GluR1 阳性表达Fig 1GluR1 positive staining　(略)

　　3讨论

　　AMPA受体是由4种亚单位GluR1 GluR4(或GluRA GluRD)组成的异源型4聚体复合物. GluR1是AMPA受体的一个重要组成部分，对正常的快突触传递、LTP的表达及空间记忆均具有关键性的作用［3］. 在诱导LTP的强直刺激后，首先是含有GluR1的AMPA受体插入到突触后膜，随后才出现突触传递的持续增强［4］. 因此GluR1与正常突触传递、突触可塑性以及空间学习记忆均密切相关. 我们的研究结果表明GluR1在海马结构广泛表达，也提示GluR1与海马功能，如LTP的形成、空间记忆等密切相关. 本实验结果表明，GluR1在海马CA1和CA3区的表达有着明显差异，在CA1区主要表达于膜结构，而在CA3区还可在胞质表达. 研究资料显示，AMPA受体可分布于谷氨酸能突触特化区内，也可聚集于突触特化区的周围；还有研究发现它可位于细胞内，如高尔基体、内质网、棘器等［5］. 一般情况下，受体位于突触膜才具有功能；胞质内的受体往往与受体的循环和转运有关. 在GluR1合成和聚合后，在受体的插入、内化及降解过程中，锚靠蛋白和转运蛋白的相互作用控制受体的转运和循环，并通过磷酸化和去磷酸反应调节受体活性和亚单位特异性. 在这一系列过程中，有多种物质参与，并起着重要的调节作用，如synapseassociated protein 97 ku （SAP97）、4.1N蛋白、蛋白激酶A（PKA）、蛋白激酶C（PKC）以及NmethylDaspartate （NMDA）受体等. 由于这些物质在不同的脑区及不同神经元内的含量不同，因而影响GluR1在不同神经元的分布及其功能［1,6］. 本实验结果显示GluR1在海马CA1和CA3区的表达差异，可能与这两个部位的功能差异有关，因为在海马CA1区和CA3区LTP的发生机制不同［7］，其神经元的动力学和药特性亦不同［8］.

 　　【】

　　［1］  Song I, Huganir RL. Regulation of AMPA receptors during synaptic plasticity ［review］ ［J］. Trends Neurosci, 2002; 25(11):578-588.

　　［2］  Lee HK, Takamiya K, Han JS, Man H, Kim CH, Rumbaugh G, Yu S, Ding L, He C, Petralia RS, Wenthold RJ, Gallagher M, Huganir RL. Phosphorylation of the AMPA receptor GluR1 subunit is required for synaptic plasticity and retention of spatial memory ［J］. Cell, 2003; 112(5): 631-643.

　　［3］ Reisel D, Bannerman DM, Schmitt WB, Deacon RM, Flint J, Borchardt T, Seeburg PH, Rawlins JN. Spatial memory dissociations in mice lacking GluR1 ［J］. Nat Neurosci, 2002; 5(9):868-873.
 
　　［4］ Shi SH, Hayashi Y, Esteban JA, Malinow R. Subunitspecific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons ［J］. Cell, 2001;105(3):331-343.
 
　　［5］ Nusser Z. AMPA and  NMDA receptors: Similarities and differences in their synaptic distribution ［review］ ［J］. Curr Opin Neurobiol, 2000; 10:337-341.
 
　　［6］ Barry MF, Ziff EB. Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses ［review］ ［J］. Currt Opin Neurobiol, 2002; 12:279-286.
　
　　［7］ Kanterewicz BI, Urban NN, McMahon DB, Norman ED, Giffen LJ, Favata MF, Scherle PA, Trzskos JM, Barrionuevo G, Klann E. The extracellular signalregulated kinase cascade is required for NMDA receptorindependent LTP in area CA1 but not area CA3 of the hippocampus ［J］. J Neurosci, 2000; 20(9):3057-3066.
　　
　　［8］ Arai A, Lynch G. Response to repetitive stimulation of AMPA receptors in patches excised from fields CA1 and CA3 of the hippocampus ［J］. Brain Res, 1996; 716:202-206.