黄芪蛰虫合剂体外抗乙型肝炎病毒的作用观察

          作者： 党双锁，陈云茹，程延安，张正国，王宝峰，张欣，宋平

【关键词】  黄芪蛰虫合剂；HepG2.2.15细胞；肝炎病毒,乙型

    【Abstract】 AIM: To evaluate the inhibitive effects of Astragalus and Thoroughfare decoction against hepatitis B virus（HBV） in vitro. METHODS: HepG2.2.15 cells, as target cells,  were exposed to different concentrations of Interferon α (IFNα) or Astragalus and Thoroughfare decoction respectively. Realtime PCR was applied to quantify extracellular HBV DNA and enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) was used to assess HBsAg and HBeAg. RESULTS: The 50% inhibitory concentration (IC50) of Astragalus and Thoroughfare decoction against HBsAg, HBeAg, and extracellular HBV DNA was 1.35, 1.92 and 2.19 g/L respectively, and treatment index (TI)>3.56-5.79.  αIFN had weak inhibitory effects against HBV. CONCLUSION: Astragalus and Thoroughfare decoction can inhibit HBV replication in vitro to some extent.

    【Keywords】 Astragalus and Thoroughfare decoction;  HepG2.2.15 cell; Hepatitis B Virus

    【摘要】 目的： 观察黄芪蛰虫合剂体外抗乙型肝炎病毒 (HBV) 的作用. 方法： 以HepG2.2.15细胞为靶细胞，分别加入不同浓度的黄芪蛰虫合剂和α干扰素. 采用ELISA法及荧光定量PCR法，测定药物对细胞培养上清HBsAg, HBeAg及细胞外HBV DNA的抑制作用. 结果： 黄芪蛰虫合剂具有一定程度的抗HBV的作用，其抑制HBsAg, HBeAg及细胞外HBV DNA的50 %抑制浓度(IC50)分别为1.35, 1.92, 2.19 g/L. 指数（TI）>3.56~5.79. αIFN也有抑制HBV的作用，但抑制作用较弱. 结论： 黄芪蛰虫合剂具有一定的体外抗HBV作用.

    【关键词】 黄芪蛰虫合剂；HepG2.2.15细胞；肝炎病毒，乙型

     我国为乙型肝感染的高发区［1］. 目前，尚没有理想的治疗慢性乙型肝炎的药物. 我国有数千年应用中草药治疗疾病的传统和经验，从中已发现了不少抗乙型肝炎病毒（HBV）的有效单方和复方制剂. 黄芪蛰虫合剂是基于理论研究和临床观察，将黄芪、蛰虫、党参、白术、炙甘草及枸杞这六味中药按君、臣、佐、使进行配伍而自制的复方合剂. 在临床初步试用中发现其具有恢复肝功能、提高机体免疫力、抗肝纤维化和抑制病毒复制的作用. 动物实验表明，黄芪蛰虫合剂对肝纤维化有良好的抑制作用［2］. 我们采用含HBV基因转染的2.2.15细胞株为靶细胞，观察不同浓度黄芪蛰虫合剂体外对HBV的抑制作用.

    1材料和方法

    1.1材料黄芪蛰虫合剂为自行煎煮，水浴蒸发浓缩至生药浓度为1000 g/L. 尼龙网过滤后经2000 r/min离心，过滤除菌后备用. 实验时用培养液稀释，分别配制成10, 5, 2.5, 1.25, 0.625 g/L共5个浓度梯度. αIFN由深圳市海王生物工程有限公司提供，实验时分别用培养液稀释成5×105, 2.5×105, 1.25×105 IU/L. 噻唑蓝（MTT, Sigma公司）；二甲基亚砜（DMSO, Sigma公司）；HBsAg和HBeAg的ELESA检测试剂盒（上海华泰生物工程公司），DG5031型酶联免疫检测仪（国营华东管厂）；HBV DNA提取及扩增荧光检测试剂盒（广州中山大学达安基因股份有限公司），PE7700型自动荧光PCR检测仪（美国Perkin Elmer公司）；HepG2.2.15细胞由第四军医大学唐都全军感染病诊疗中心张岩博士惠赠；DMEM、胰蛋白酶、L谷氨酰胺(Gibco公司)； 胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；G418 (Sigma公司)；青、链霉素（华北制药厂）.

    1.2方法

    1.2.1细胞培养［3］用含200 mL/L胎牛血清、400 mg/L G418, 1.0×105 U/L青、链霉素及0.3 g/L L谷氨酰胺的DMEM培养液培养细胞，56 g/L碳酸氢钠调pH值到7.2. 用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代. 取对数生长期状态良好的细胞，调整细胞数为1×107/L，接种于96孔板，每孔0.2 mL，于37℃, 50 mL/L CO2培养箱培养48 h，待细胞贴壁后进行试验. 两种药物按配制不同浓度分组，每一浓度设3个复孔，同时设仅加细胞培养液的空白对照. 每3日换同样浓度含药培养液及对照培养液1次. 各孔用药第3, 6, 9日将吸去的上清液置于-20℃冰箱保存待检.

    1.2.2药物对细胞毒性试验采用MTT法. 于加药第9日吸去上清液，每孔加5 g/L MTT 20 μL, 37℃培养4 h，弃上清液后每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min，测A490 nm值. 细胞存活率，按下列公式计算半数中毒浓度（TC50）［4］. 细胞存活率（%）=（实验组A490 nm值/阴性对照组A490 nm值）×100%. TC50=Anti log［logB+(50-B)的抑制百分率〖〗(A-B)的抑制百分率×C］. （A=＞抑制50%药物浓度，B=＜抑制50%药物浓度，C=log稀释倍数）.

    1.2.3HBsAg, HBeAg测定使用双抗体加心ELESA法. 根据试剂盒说明测定培养上清液HBsAg, HBeAg，记录P/N值，按下列公式计算50%药物抑制浓度（IC50）. 抗原抑制率（%）=（对照孔P/N值-实验孔P/N值）/（对照孔P/N值-2.1）×100%. IC50=Anti log［logB+(50-B)的抑制百分率〖〗(A-B)的抑制百分率×C］（A=＞抑制50%药物浓度，B=＜抑制50%药物浓度，C= log稀释倍数）.

    1.2.4细胞培养上清HBV DNA检测采用Taq man荧光定量PCR法检测. 按照HBV核酸扩增荧光检测试剂盒说明操作. 引物序列为P1: 5′ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT 3′; P2: 5′ACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAA 3′；荧光探针序列为: 5′TGGCTAGTTTACTAGTGCCATTTG 3′. 各反应管放入PCR仪，按下列条件扩增： 93℃ 2 min预变性，然后93℃ 45 s到55℃ 1 min循环扩增10个循环，再按93℃ 30 s到55℃ 45 s循环扩增，共30个循环. 反应结束后由计算机自动分析出HBV DNA定量结果. 计算HBV DNA抑制率. HBV DNA抑制率（%）=（阴性对照组HBV DNA拷贝数-实验组HBV DNA拷贝数）/阴性对照组HBV DNA拷贝数×100%.

    1.2.5治疗指数的计算HBsAg和HBeAg的治疗指数(TI)=半数毒性浓度(TC50)/半数有效浓度(IC50). 其中TI≥2为有效低毒；1

    统计学处理：  数据以x±s表示，应用SPSS统计软件进行分析，组间比较采用方差分析，实验组和对照组比较采用LSDt检验.

    2结果

    2.1药物对HepG2.2.15细胞毒性测定黄芪蛰虫合剂不同浓度组的细胞存活率显示，黄芪蛰虫合剂对细胞的毒性作用非常小，其10, 5 g/L的抑制率分别为59.7%, 32.3%, TC50为7.8 g/L. αINF仅在浓度达5×105 IU/L时细胞存活率为48%，其余浓度对细胞生长未见明显毒性.

    2.2药物对HepG2.2.15细胞培养上清HBsAg, HBeAg的抑制作用黄芪蛰虫合剂的不同浓度对HBsAg, HBeAg分泌均有一定的抑制作用，且随剂量的增加、治疗时间的延长对HBV的抑制也随之增强. 计算第9日HBsAg的IC50为1.35 g/L, HBeAg的IC50为1.92 g/L. αINF抑制HBV分泌抗原的能力较弱（表1）.

    2.3药物对HepG2.2.15细胞培养上清HBV DNA的抑制作用黄芪蛰虫合剂的不同浓度对HBV DNA的分泌均有一定的抑制作用，且随剂量的增加、时间的延长对HBV的抑制也随之增强. 第9日HBV DNA的IC50为2.19 g/L. αINF也可在一定程度上抑制HBV DNA的分泌，其第9日HBV DNA的IC50为4.54×105 IU/L（表1）.

    3讨论

    近年来，一批中药经过实验研究及临床应用证实有一定的抗病毒作用. 如刘天灯等［5］用苦参素治疗慢性乙型肝炎28例，发现苦参素组HBeAg, HBV DNA的阴转率均与干扰素相近. 同样，吴清和等［6］用血清药的方法研究了三黄乙肝胶囊对HBsAg的体外抑制作用，发现由黄芩、柴胡、黄芪、五味子、大黄、甘草等药组成的三黄乙肝胶囊，对家兔血清HBsAg具有明显的抑制作用，并随血清中药浓度的升高、作用时间的延长而增强.

    HepG2.2.15细胞株是一种在染色体上整合了HBV基因组的肝肿瘤细胞株，可以向培养液中稳定持久的分泌HBsAg, HBeAg和HBV DNA，根据培养液上清或胞内病毒DNA拷贝数的变化为体外筛选抗HBV药物提供了细胞模型［7］，为开发新型抗HBV中药提供了手段. 晏雪生等［8］用HepG2.2.15研究海珠益肝胶囊对HBeAg，HBsAg的抑制作用. 发现海珠益肝胶囊在体外具有明显的抑制HBeAg和HBsAg表1药物对HepG2.2.15细胞培养上清HBsAg，HBeAg及HBV DNA的抑制作用，并且各浓度间存在着量效关系，其中对HBeAg的作用优于对HBsAg的作用. 邹宇宏等［9］研究了黄芪提取物抗HBV的作用，发现黄芪总苷及黄芪多糖对HBsAg，HBeAg的分泌均有抑制作用.

    在黄芪蛰虫合剂中，其复方成分互相辅助，通过药理学的相互作用，达到了增强效果或减少副作用的目的. 黄芪含糖、苷、生物碱、黄酮类、多种氨基酸及微量元素，可产生多种生物学活性，包括抗病毒、调节机体免疫、促进干扰素系统的功能及延长细胞体外存活等作用，对乙肝表面抗原阳转阴有一定作用，是临床常用的抗肝炎药物. 蛰虫具有逐瘀、破积、通络的作用，常用于症瘕积聚、血瘀经闭等病证的治疗. 枸杞提取物可提高免疫系统功能，党参和黄芪一样，均可提高机体免疫力. 我们的实验结果也表明，黄芪蛰虫合剂的各个实验浓度组均对HBsAg，HBeAg及HBV DNA的分泌有不同程度的抑制作用，其可能机制： ① 抑制HepG2.2.15细胞的增殖；② 抑制了HBV基因的复制；③ 对其相关酶类或受体活性的抑制，而产生抑制这种DNA病毒的作用，但其机制还有待于进一步研究.

    【】

    ［1］ 陈云茹，袁利超，党双锁. 黄芪多糖治疗慢性病毒性乙型肝炎［J］. 世界最新医学信息文摘, 2004,3(3):1130-1131.

    ［2］ Dang SS, Jia XL, Cheng YA, et al. Inhibitory effect of Huangqi Zhechong decoction on liver fibrosis in rat［J］. World J Gastroenterol, 2004,10(15):2295-2298.

    ［3］ 党双锁. 医学常用实验技

    2.3药物对HepG2.2.15细胞培养上清HBV DNA的抑制作用黄芪蛰虫合剂的不同浓度对HBV DNA的分泌均有一定的抑制作用，且随剂量的增加、治疗时间的延长对HBV的抑制也随之增强. 第9日计算HBV DNA的IC50为2.19 g/L. αINF也可在一定程度上抑制HBV DNA的分泌，其第9日HBV DNA的IC50为4.54×105 IU/L（表1）.

    3讨论

    近年来，一批中药经过实验研究及临床应用证实有一定的抗病毒作用. 如刘天灯等［5］用苦参素治疗慢性乙型肝炎28例，发现苦参素组HBeAg, HBV DNA的阴转率均与干扰素相近. 同样，吴清和等［6］用血清药理学的方法研究了三黄乙肝胶囊对HBsAg的体外抑制作用，发现由黄芩、柴胡、黄芪、五味子、大黄、甘草等药组成的三黄乙肝胶囊，对家兔血清HBsAg具有明显的抑制作用，并随血清中药浓度的升高、作用时间的延长而增强.

    HepG2.2.15细胞株是一种在染色体上整合了HBV基因组的肝肿瘤细胞株，可以向培养液中稳定持久的分泌HBsAg, HBeAg和HBV DNA，根据培养液上清或胞内病毒DNA拷贝数的变化为体外筛选抗HBV药物提供了细胞模型［7］，为开发新型抗HBV中药提供了手段. 晏雪生等［8］用HepG2.2.15研究海珠益肝胶囊对HBeAg，HBsAg的抑制作用. 发现海珠益肝胶囊在体外具有明显的抑制HBeAg和HBsAg表1药物对HepG2.2.15细胞培养上清HBsAg，HBeAg及HBV DNA的抑制作用，并且各浓度间存在着量效关系，其中对HBeAg的作用优于对HBsAg的作用. 邹宇宏等［9］研究了黄芪提取物抗HBV的作用，发现黄芪总苷及黄芪多糖对HBsAg，HBeAg的分泌均有抑制作用.

    在黄芪蛰虫合剂中，其复方成分互相辅助，通过药理学的相互作用，达到了增强效果或减少副作用的目的. 黄芪含糖、苷、生物碱、黄酮类、多种氨基酸及微量元素，可产生多种生物学活性，包括抗病毒、调节机体免疫、促进干扰素系统的功能及延长细胞体外存活等作用，对乙肝表面抗原阳转阴有一定作用，是临床常用的抗肝炎药物. 蛰虫具有逐瘀、破积、通络的作用，常用于症瘕积聚、血瘀经闭等病证的治疗. 枸杞提取物可提高免疫系统功能，党参和黄芪一样，均可提高机体免疫力. 我们的实验结果也表明，黄芪蛰虫合剂的各个实验浓度组均对HBsAg，HBeAg及HBV DNA的分泌有不同程度的抑制作用，其可能机制： ① 抑制HepG2.2.15细胞的增殖；② 抑制了HBV基因的复制；③ 对其相关酶类或受体活性的抑制，而产生抑制这种DNA病毒的作用，但其机制还有待于进一步研究.

    【参考文献】

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    ［8］ 晏雪生，李翰曼，彭亚琴. 海珠益肝胶囊对2.2.15细胞乙肝病毒标志物的影响［J］. 中医药学刊，2004,22(4):609-610.

    ［9］ 邹宇宏，杨雁，吴强，等. 黄芪提取物的体外抗乙肝病毒作用［J］. 安徽医科大学学报，2003,38(4):267-269.

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    ［8］ 晏雪生，李翰曼，彭亚琴. 海珠益肝胶囊对2.2.15细胞乙肝病毒标志物的影响［J］. 中医药学刊，2004,22(4):609-610.

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