放射性125I粒子照射小鼠膀胱癌模型的实验研究
【关键词】 碘
【Abstract】 AIM: To get insights into the biological effect of implanting 125I seeds to treat bladder cancer model of T139 mice and to provide an experimental basis for clinical utilization of 125I seed brachytherapy for bladder cancer. METHODS: Eight mice models bearing T139 bladder cancer were divided into 2 groups (experimental, 4; control, 4) at random. 125I seeds were implanted into the tumor in experimental group while the empty seed was implanted in the control group at the same position as the experimental group. The experimental mice were executed after 24 d. Three tissues were cut from different positions according to the different distance (0.6, 1.2, 1.8 cm) from the implanted 125I seeds and the tumor cells were primarily cultured and the pathomorphological changes, growth and proliferation of tumor cells were dynamically recorded. Tumor cell count, efficiency and inhibitory rate of colony formation were calculated. RESULTS: ① The cell number of experimental group was obviously fewer than that of control group at the same time point. There was a significant difference in the number of cultured cells from different positions of experimental group. ② The inhibitory rate of colony formation was 41.84%. ③ Variance analysis of total cloning efficiency of the cells from different positions showed a significant difference between experimental group and control group (P<0.01), and among different positions of experimental group (P<0.01). CONCLUSION: The γ radiation from implanted 125I seeds directly destroys tumor cells within the effective range. The radiation dose and killing effect of γray decreased with the increasing distance from 125I seeds.
【Keywords】 125I seed; bladder neoplasms; interstitial implant; mice
【摘要】 目的： 揭示125I粒子照射膀胱癌的生物学效应，为临床应用125I粒子膀胱癌提供实验依据. 方法： 把T739近交系小鼠膀胱低分化移行细胞癌动物8只随机分为两组，实验组和对照组，每组4只. 在小鼠瘤体内植入MSI125型125I粒子，在对照组小鼠瘤体内相应部位植入粒子空壳，继续饲养24 d后处死. 在距粒子植入部位0.6, 1.2, 1.8 cm的小鼠肿瘤内分别取3块组织，分离后行癌细胞培养，显微镜下动态观察细胞病理形态变化及生长、增殖状况. 统计克隆形成率，克隆形成抑制率. 结果： ① 实验组细胞数量明显少于对照组. 实验组不同部位的培养细胞数量有较明显差异. ② 实验组克隆形成抑制率为41.84%. ③ 两组不同部位所取组织细胞的总体克隆形成率有显著差异（P<0.01），实验组不同部位间亦有显著差异(P<0.01). 结论： 植入的125I粒子主要是靠γ射线的穿透力在有效射程内直接杀伤癌细胞，随着距离延长，辐射剂量减少，γ射线对癌细胞杀伤作用下降.
【关键词】 碘125粒子；膀胱肿瘤；组织间植入；小鼠
膀胱癌作为一种高发的恶性泌尿系肿瘤，其放疗实践与研究只局限于外放疗和腔内放疗，对于组织间种植治疗的应用较少［1］，其基础性研究也鲜见报道. 我们通过对125I粒子植入治疗膀胱癌产生的生物学效应的实验研究，揭示125I粒子的杀瘤效应，为临床应用125I粒子治疗膀胱癌提供实验基础.
1材料和方法
1.1材料T739近交系普通清洁级小鼠4 wk龄8只，雌雄随机，由同济大学医学院实验动物中心提供. 含小鼠可移植性膀胱移行细胞癌株（BTT739）的荷瘤T739小鼠2只作瘤源，由上海市第一人民病理科提供. MSI125型125I粒子由原子能研究院同位素研究所提供. 摄像显微镜(Nikon Fx35DX，日本尼康公司). 二氧化碳孵育箱（NAPCO，U.S.A）.
1.2方法
1.2.1建立膀胱癌动物模型用T739近交系小鼠8只，通过瘤源接种的方法建立BTT739源于化学致癌剂NbutylN（4hydroxybutyl）nitrosamine（BBN）诱导的T739近交系小鼠膀胱低分化移行细胞癌动物模型. 随机分为两组： 实验组4只，对照组4只.
1.2.2种植125I粒子在实验组小鼠瘤体内植入MSI125型125I粒子，待移植瘤长到直径约0.7 cm大小后，在瘤体内偏心约1/4处植入一枚MSI125型125I粒子；在对照组小鼠瘤体内相应部位植入粒子空壳，继续饲养24 d后用颈椎脱位法处死全部实验小鼠. 于无菌条件下，在距粒子植入部位0.6, 1.2, 1.8 cm的小鼠肿瘤内分别取3块组织记作a, b, c部位.
1.2.3细胞培养、克隆① 瘤细胞的分离： 无菌条件下将取下的瘤结分别处理. 先各移入一干净平皿中，加入4℃含青霉素10万u，链霉素0.1 g的PBS缓冲液，没过除去包膜、血块及坏死组织的瘤结，漂洗3～4次. 再将瘤结分别移入一干净平皿中，加入4℃ RPMI1640合成培养液没过瘤结，用眼科剪轻轻剪碎瘤结，成1 mm×1 mm×1 mm大小的小瘤块. 用2.5 g/L胰酶37℃水浴消化1～1.5 h，每15 min摇1次. 将自制的滤网罩于烧杯口上，用研磨棒轻轻碾磨上述胰酶消化过的瘤块，收集烧杯中的癌细胞滤液. 4℃, 500 r/min离心5 min，弃上清液后，用吸管小心除去上层血细胞、结缔组织. 再用RPMI1640培养液重悬后，以相同条件离心纯化细胞，重复3～4次. 最后将收集的癌细胞重悬于37℃预热的RPMI1640培养液中，用毛细吸管反复吹打，使细胞尽量分散. 取0.9 mL稀释的癌细胞悬液用0.1 mL的台盼蓝染色液染色，滴一滴于血细胞计数板上，在光镜下观察癌细胞的活率并计数，制成1×1010/L的癌细胞悬液备用. ② 癌细胞培养：将上述制成的1×1010/L的癌细胞悬液，分别接种至25 mL培养瓶中，每瓶加含200 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液3 mL，在37℃, 50 mL/L CO2条件下置二氧化碳培养箱培养. 待细胞贴壁后，首次换液，以后每24 h换培养液1次.
1.2.4观察细胞形态变化显微镜下动态观察细胞形态变化及生长、增殖状况. 克隆计数：统计大于50个细胞的克隆. 比较实验、对照两组细胞a, b, c 3个部位分别培养的克隆形成率. 克隆形成抑制率. 克隆形成抑制率=（1-实验组克隆均数/对照组克隆均数）×100%.
统计学处理： 应用SPSS统计分析软件包，析因设计的方差分析，P＜0.05时有统计学意义.
2结果
2.1培养的膀胱癌细胞生长特性酶消化的上皮细胞在贴壁前呈圆形或类圆形，胞质透亮，轮廓光滑，显微镜下观察富有立体感. 接种后12 h，部分细胞开始贴壁于培养瓶内壁上，24～72 h细胞贴壁数量增多. 初始细胞呈圆形折光性强，贴壁后，细胞逐渐伸展，胞A： 实验组a部位，细胞总体数量明显较少，不规则细胞形态较多；B： 实验组b部位，细胞总体数量较少，不规则细胞形态较少；C： 实验组c部位，细胞总体数量较多，不规则细胞形态较少； D： 对照组，细胞总体数量明显较多，可见上皮细胞生长融合成片，似铺路石状.
图1两组不同部位培养细胞形态A： 台盼蓝染色： ×200, B,C,D： 台盼蓝染色×100
质展开，细胞变成扁平状，折光性减低，胞核清晰可见. 细胞体积约为贴壁前2倍. 接种5 d后细胞增殖明显，细胞数量明显增多. 进入指数生长期，可见核分裂相；8～10 d上皮细胞逐渐生长融合成片，似铺路石状. 接种1 wk时，两组各部位培养细胞形态见图1，实验组细胞数量较同一时间的对照组细胞数量明显为少，可见细胞形态不规则，贴壁细胞离壁、变圆等. 同一时间实验组a部位与b, c部位的细胞数量有较明显的差异，b, c部位之间差异不大，而对照组a, b, c 3个部位的细胞数量则差异不大.
2.2两组小鼠肿瘤受照射后3部位的肿瘤细胞克隆形成率实验组与对照组的肿瘤细胞克隆形成率有差异（P＜0.01），实验组不同部位间有差异（P＜0.01），其中a部位与b, c部位之间有差异（P＜0.01），而b, c部位之间无差异（P＞0.05）；对照组不同部位间无差异（P＞0.05，图2）. 部位与处理之间无交互作用. 根据公式计算克隆形成抑制率为41.84%.
3讨论
低剂量率近距离肿瘤的放射生物学特点，在于连续照射过程中，肿瘤细胞损伤效应累积，进而抑制细胞增殖. 增殖期细胞被杀伤后，处于非增殖期和细胞周期G0期的细胞进入敏感的G2/M期. 持续不间断的照射，乏氧细胞再氧合，增加放射敏感性. 如果细胞死亡超出了细胞新生，再增殖将不再发生［2］. 电离辐射致细胞死亡可以是坏死，也可以是凋亡［3］. 光镜下观察到明显的细胞形态学改变，如细胞形态不规则，贴壁细胞离壁、变圆等，与［4-5］报道的凋亡时贴壁细胞的形态学改变相一致，提示γ射线可能诱导瘤细胞发生了凋亡. 在相当剂量下，坏死和凋亡对决定治疗效果具有同等重要的作用，瘤组织中往往会发生明显的坏死，除了瘤细胞类型不同和放射敏感性不同的因素之外，很可能瘤组织坏死的直接原因不是γ射线照射的结果，而是瘤组织中放射敏感性组织（如血管内皮细胞）被破坏而引起的继发性瘤细胞的坏死.
考虑到125I粒子发射的是γ射线，是一种不带电荷的光子流，其特点是电离能力较弱，而穿透力极强；以及125I粒子照射离体肿瘤细胞的研究较多［6］，我们设计了活体接受照射，离体细胞培养克隆的实验，试图揭示活体肿瘤细胞接受125I粒子照射在机体综合因素下的真实特性. 在实验的设计操作过程中尽可能保持体外培养的细胞能反映出其在体内的生长特性. 通过对肿瘤不同部位细胞的培养、克隆我们观察到，同一时间实验组的细胞数量明显少于对照组细胞数量，说明植入125I粒子对肿瘤细胞的生长产生了影响. 进一步观察发现，实验组的培养细胞在同一时间a部位的细胞数量较b, c部位少，而b, c两部位之间这种差异却不明显. 这揭示了125I粒子的植入实际上主要是由于γ射线的穿透力，直接杀伤癌细胞而显示出治疗作用的. γ射线发出的能量对源附近的癌细胞产生作用而杀死癌细胞，由于是低能射线，随着距离延长，射线能量衰减明显，辐射剂量减少，从而对远离植入部位的癌细胞杀伤作用下降.
【文献】
［1］ Petrovich Z, Jozsef G, Brady LW. Radiotheray for caurcinoma of bladder［J］ . Am J Clin Oncol, 2001,24(1):1-9.
［2］ 王俊杰，唐劲天，黎功. 放射性粒子距离治疗肿瘤［M］. 北京： 北京医科大学出版社，2001:112-116.
［3］周立祥，黄海燕，罗毅男，等. Bcl2和953在放射性粒子近距离治疗脑胶质瘤中的作用和意义［J］. 医药研究, 2004,2(6):5-7.
［4］ Berrada M, Yang Z, Lehnert S. Tumor treatment by sustained intratumoral release of 5fluorouracil: Effects of drug alone and in combined treatments［J］. Int J Radio Oncol, Biol, Phys, 2002,54(5):1550-1557.
［5］ Mobit P, Badragan I. Dose perturbation effects in prostate seed implant brachytherapy with I125［J］. Phys Med Biol, 2004,49(14):3171-3178.
［6］ Yuan SS, Chang HL, Chen HW, et al. Annonacin, a monotetrahydrofuran acetogenin, arrests cancer cells at the G1 phase and causes cytotoxicity in a Bax and caspase3related pathway［J］. Life Sci, 2003,72(25):2853-2861.
