环孢菌素A两种不同产生菌原生质体的制备和再生

              作者：林永勉 郑孝贤 郑卫 程元荣 

【摘要】  以环孢菌素A两种不同产生菌——雪白白僵菌和茄病镰刀菌为出发菌株，开展了原生质体制备和再生条件的研究，并分别实现了两个不同种的菌株原生质体再生。

【关键词】  环孢菌素A 雪白白僵菌 茄病镰刀菌 原生质体

    Formation and regeneration of protoplasts from two

      ABSTRACT  Protocols for formation and regeneration protoplasts for two different fungus species, Beauveria nivea and Fusarium solani, were described. High yield of protoplasts was obtained by using a combined enzyme system containing lywallzyme and snailase. The effects of factors such as osmotic stabilizers, cultivation time, temperature, pH, incubation time on the formation and regeneration were studied.

    KEY WORDS  Cyclosporin A;  Beauveria nivea;  Fusarium solani;  Protoplast

    环孢菌素A(cyclosporin A)是由11个氨基酸组成的环肽，已作为高效免疫抑制剂在人体器官移植上广泛应用［1］。1976年瑞士Sandoz公司首次报道了由半知菌属多孔木霉(Tolypocladium inflatum)［后更名为雪白白僵菌Beauvcria nivea)］和光泽柱孢菌(Cylindrocarpon lucidum)产生的环孢菌素A［2］。此后各国的家又陆续报道了由13种其他产生菌，如茄病镰刀菌(Fusarium solani)和侵菅新赤壳菌(Neocosmospora varinfecta)等产生环孢菌素A。福建省微生物研究所于1983年首次报道了从我国土壤中筛选到环孢菌素A的产生菌茄病镰刀菌4?11，在国内率先研制成功环孢菌素A［3，4］。根据Ains worth的真菌分类法，茄病镰刀菌和国际上常用的环孢菌素A产生菌雪白白僵菌分别属于丝孢纲(Hyphomycetes)的丝孢目(Hyphomycetales)和瘤座孢目(Tuberculariales)。这两种产生菌不但在形态、培养特征和生理特性上有所不同， 而且在化生产工艺和结果各有不同的特点。茄病镰刀菌生产环孢菌素A具有发酵培养基成本低，发酵周期短(5d)的优点，但环孢菌素A效价和组分含量偏低；雪白白僵菌生产环孢菌素A具有环孢菌素A效价和组分含量较高的优点，但发酵培养基成本高，发酵周期长(10～15d)。Kim等［5］利用雪白白僵菌进行种内融合，所获得的依赖L?Val和L?Leu的融合株环孢菌素A效价高达8920 mg/L，但发酵所需的培养基价格昂贵，使用培养基中氨基酸含量高达36g/L，发酵周期长达10～13d。我们设想将两种不同的环孢菌素A产生菌的菌种进行目间原生质体融合，试图筛选出集合两个不同菌种优点的融合子应用于生产，获得提高环孢菌素A生产能力和效益的新菌株。本文报道以雪白白僵菌和茄病镰刀菌为出发菌株，分别进行原生质体制备与再生条件的研究。

    1  材料和方法

    1.1  菌种

    茄病镰刀菌S?42?150?2和雪白白僵菌X?441?50均由福建省微生物研究所提供。

    1.2  培养基

    PDA液体培养基  称取20g去皮土豆，切成小块状，加适量水煮30min。用4层纱布过滤，弃去滤渣，于滤液中加入2g葡萄糖，定容到100ml。

    PDA斜面琼脂培养基  100ml PDA液体培养基加琼脂2g进行制备。

    PDA再生培养基  PDA液体培养基，酵母浸汁(膏状)0.3g，KCl 3.9g，琼脂2g，定容至100ml。

    1.3  试剂

    纤维素酶(cellulase)厦门泰京生物技术有限公司；蜗牛酶(snailase)厦门泰京生物技术有限公司；溶壁酶(lywallzyme)广东省微生物研究所；二硫苏糖醇(DDT)厦门泰京生物技术有限公司。

    渗透压稳定剂分别为0.6mol/L的KCl、NaCl、MgSO4·7H2O、D?甘露醇、D?山梨醇和蔗糖溶液。

    1.4  原生质体的制备

    分别挑取一环雪白白僵菌和茄病镰刀菌斜面琼脂培养物接种于PDA液体培养基中，摇瓶装量为40ml/250ml三角瓶，26℃、200r/min培养一定时间后投入若干个直径为0.3mm的玻璃珠，振荡20min。用玻璃砂心漏斗G3过滤。取0.2g湿菌体，加入1ml 0.01mol/L的DDT，混匀，静置20min后10000r/min离心10min，弃去上清液，将菌丝体沉淀悬浮于2ml无菌水中，10000r/min离心10min。弃去上清夜，加入1ml不同的酶溶液，混匀，置于28℃水浴锅中，每小时用吸管吹吸3次，血球计数板计数。酶解结束后补加1ml 0.6mol/L KCl，吹吸3次，用3层擦镜纸过滤，滤液转入到离心管中。3000r/min离心7min，弃去上清液，将原生质体悬浮于1ml 0.6mol/L KCl中，血球计数板计数。

    1.5  原生质体的再生

    将制备好的原生质体悬浮液用0.6mol/L KCl溶液作适当稀释，于PDA再生培养平板上涂布0.1ml；原生质体再生对照系将原生质体用无菌水进行低渗处理，后涂布于再生培养基上。26℃培养5～7d观察再生菌落，同时进行再生菌数计数：

    再生率=实验组再生菌落数-对照组再生菌落数原生质体数×100%

    2  结果与讨论

    2.1  酶液组成对原生质体形成的影响

    采用溶壁酶、蜗牛酶和纤维素酶组成9组酶液分别酶解菌龄为24h的雪白白僵菌和茄病镰刀菌菌丝，以0.6mol/L的KCl为稳定剂(pH6.0，反应温度28℃，反应时间4h)，结果见表1。

    由表1看出，溶壁酶与蜗牛酶混合液酶解菌体时，形成原生质体量最多。不同种类的真菌制备原生质体所需条件和生成的量相差较大，雪白白僵菌形成原生质体需要酶浓度较低(0.5%溶壁酶+0.5%蜗牛酶)，形成原生质体较多，达到8.0×107个/ml(图1A)。茄病镰刀菌在较高浓度酶液(1%溶壁酶+1%蜗牛酶)中形成5.3×105个/ml原生质体(图1B)。利用复合酶进行破壁，效果比单个酶作用要好。单用纤维素酶或蜗牛酶作用于菌丝体未发现原生质体的产生，而单用溶壁酶可以水解细胞壁结构产生原生质体，并且在蜗牛酶辅助作用下原生质体数量达到最多。

    2.2  菌龄对原生质体形成的影响

    菌龄是制备原生质体过程中重要的因素。以0.6mol/L的KCl为稳定剂(pH6.0，反应温度28℃)，4h后观察，结果如图2。在26℃培养28h的雪白白僵菌或培养16h的茄病镰刀菌菌丝制备的原生质体量最多，表明该时期细胞壁结构正适合于制备原生质体。对表1    酶液组成对原生质体形成的影响数期前的菌丝细胞结构对降解酶不敏感，细胞壁和原生质体膜难于分离，造成原生质体释放困难［6］。处于对数生长期的年轻菌丝易于酶解，此时菌丝体内源溶壁酶分泌量大，有利于原生质体的释放［7，8］。

    2.3  渗透压稳定剂对原生质体形成的影响

    渗透压稳定剂的性质和浓度是维持和控制原生质体数量的重要因素。分别以0.6mol/L稳定剂D?山梨醇、蔗糖、D?甘露醇、NaCl、KCl和MgSO4·7H2O制备原生质体，结果表明，雪白白僵菌在0.6mol/L NaCl下制备的原生质体数量最多，茄病镰刀菌以0.6mol/L NaCl和MgSO4·7H2O为稳定剂时原生质体数量最多(表2)。

    2.4  温度对原生质体形成的影响

    依据酶反应动力学原理，原生质体制备液的酶解温度和pH均可直接影响酶促反应的速率和原生质体化程度。在不同的温度下进行酶解，结果发现两种菌丝酶解4h后，茄病镰刀菌在32℃形成原生质体数最多，而雪白白僵菌在28～36℃范围内都可以获得较多的原生质体数量(图3)。 表2    透压稳定剂对原生质体形成的影响

    2.5  pH对原生质体形成的影响

    比较酶液在pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的0.2mol/L柠檬酸钠－磷酸氢二钠缓冲液里作用原生质体，结果表明在pH6.0～7.0范围内对二种菌的原生质体制备均无明显影响(图4)。

    2.6  酶解时间对原生质体形成的影响

    酶解时间是制备原生质体又一个重要因素。酶作用时间不够，原生质体不能得到全部释放。但酶作用时间过长，原生质体膜稳定性降低，导致原生质体破碎［9］。雪白白僵菌在酶液32℃作用下，3h后获得最多的原生质体数。而茄病镰刀菌4h后原生质体数量达到最多(图5)。

    2.7  原生质体再生

    原生质体融合育种最重要的一个环节是必须使原生质体再生成细胞，然后才能在普通培养基上繁殖。分别以0.6mol/L D?山梨醇、蔗糖、D?甘露醇、NaCl、KCl和MgSO4·7H2O作为稳定剂制备PDA再生培养基，26℃培养5d后获得再生菌落(表3)。

    不同菌种的原生质体再生能力相差较大，再生培养基中的稳定剂对再生率影响也比较大。雪白白僵菌在以KCl为稳定剂的培养基中的再生率为4.7%，而在以山梨醇为稳定剂的培养基中几乎没有生长。雪白白疆菌原生质体制备率较高，但再生率较低，其原因可能是大多数原生质体缺乏细胞核或丢失某些细胞器而不能再生［10］。茄病镰刀菌制备率低，再生率高，在以KCl为稳定剂的培养基中，其再生率高达26%。茄病镰刀菌原生质体不能在以山梨醇和甘露醇为稳定剂的培养基中再生。表3    原生质体再生率由于丝状真菌的细胞壁组成较为复杂，因此要获得大量活力较高的原生质体，选择适宜的制备和再生条件非常重要。通过以上实验确定了雪白白疆菌和茄病镰刀菌的原生质体制备和再生条件，为下一步开展原生质体目间融合的研究打下良好的基础，相关的研究工作正在进行中。

【】
  ［1］ 张之盟. 新型免疫抑制剂——环孢素A［J］. 抗生素，1986，11(5)：448

［2］ Von Wartburg A, Traber R. Cyclosporins, fungal meta?bolites with immunosuppressive activities ［J］. Prog Med Chem,1988,25:1

［3］ 唐信东，洪丽娜，缪冒城，等. 镰刀菌4?11产生环孢素Ⅰ 镰刀菌4?11的鉴定及生物学特性［J］. 抗生素，1984，9(1)：1

［4］ 洪丽娜，唐信东，缪冒城，等. 镰刀菌4?11产生环孢素Ⅱ 提取，分离，纯化和鉴别［J］. 抗生素，1984，9(1)：5

［5］ Kim J, Woo L, Kwang M, et al. PCT Int. APPL ［P］. WO 9612032,1996?04?25

［6］ 柏内特 J H 著. 刘锡进，白金铠译. 真菌学基础［M］. 北京：出版社，1989：55，180

［7］ Balasubramanian N, Juliet G A, Strikalaivani P, et al. Release and regeneration of protoplasts from the fungus Trichothecium roseum ［J］. Can J Microbial,2003,49:263

［8］ Nombela C. Microbial cell wall synthesis and autolysis ［M］. Netherlands: Elservier Science publishers B V.,1984:91

［9］ Anne J. Somatic hybridization between Penicillium species after induced fusion of their protoplasts ［J］. Agriculture (Heverlee Belg),1977:25,1

［10］ Kim B K, Kang J H, Jin M, et al. Mycelial protoplast isolation and regeneration of Lentinus lepideus ［J］. Life Sci,2000,66:1359